ESS - DM -Técnicas Laboratoriais em Biopatologia
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- Next generation sequencing of a custom gene panel to improve the diagnosis of patients with inherited predisposition to colorectal polyposisPublication . Silva, Miguel Ângelo Sota Porto da; Teixeira, Manuel António Rodrigues; Pinto, Carla Alexandra CavacoPolyposis syndromes are a group of diseases predisposing to cancer. In general, the genetic mechanisms are well established, but in recente years several pathogenic variants in emergent genes have been associated to theses phenotypes. The main goal of this study was to search for pathogenic variants in emerging genes through a customized next-generation sequencing (NGS) panel in a retrospective series of 189 individuals with a personal/family history of polyposis previously negative for pathogenic variants in the MUTYH and/or APC genes. We also aimed to complete the study of the MUTYH gene in all patients (79 cases) previously studied only for the recurrent/founder +athogenic variants. A total of 18 variants (15 different) were found in 17 patients, seven of them deleterious (six different, two of them in the same patient) and 11 (9 different) variants of uncertain significance (two of them novel). None of the 79 cases previously studied for only the reccurent pathogenic MUTYH variants presented pathogenic variants in the remaining coding regions of this gene. This study demonstrates that pathogenic variants in the emerging genes recently associated in the literature with polyposis are rare.
- Estudo de como Dad, Smad inibitória em Drosophila melanogaster, regula a via da TGFβ durante o desenvolvimentoPublication . Ramos, Raquel Sofia Alves; Pereira, Paulo; Granja, SaraA via do TGFC, altamente conservada entre metazoários, regula o crescimento, proliferação e diferenciação, desencadeando interesse por influenciar no desenvolvimento e em patologias severas. Em Drosophila, a TGFβ divide-se em dois ramos, Ativina e Proteínas Morfogénicas Ósseas (BMP). A inibição da via envolve, entre outros mecanismos, a l-Smad Daughters against DPP (Dad) por associação ao recetor tipo I e competição com a R-Smad por interação com a Co-Smad. Nesta tese, caracterizamos Dad quanto à localização e função. Predominantemente, Dad localiza-se no nucléolo e membrana plasmática, inibindo a fosforilação de Mad e desenvolvimento da retina. O domínio N-terminal de Dad é essencial na inibição eficiente, e recrutamento para a membrana plasmática, na glândula salivar. Interessantemente, a retina dispõe de mecanismos específicos para recrutamento de Dad, não dependendo apenas do N-terminal. A hiperativação do recetor Tkv, recupera a diferenciação da retina na presença de Dad. Dad é inibido pela fosforilação induzida por hiperativação de Punt e Tkv. Gilgamesh (Gish), uma proteína cinase associada à membrana plasmática, regula Dad promovendo a diferenciação da retina. Na tentativa de identificar locais putativos de fosforilação por Gish, mutamos Dad nos resíduos de Ser535 e Ser539. Gish mantém a capacidade de dissociar Dad mutado da membrana plasmática.
- Doping genético: de atleta de elite a superatletaPublication . Gomes, Bárbara Sofia da Cunha MoreiraO doping é uma realidade que existe desde tempos antigos e prevalece até aos dias de hoje. Com o desenvolvimento da ciência no campo das terapias génicas, surge em paralelo, a possibilidade de essas terapias serem utilizadas para melhorar a performance dos atletas de elite, tornando-os em superatletas, com o atrativo de ainda não existir um procedimento padronizado e de confiança para detetar a infração. O objetivo desta dissertação é fazer um estado-d'arte da bibliografia relevante sobre o tema desde 2010, de forma a ser uma ferramenta de apoio para estudos práticos posteriores. Assim, os fundamentos teóricos dos métodos de transferência do material genético para o organismo do atleta, das técnicas de edição génica, dos possíveis genes alvo a serem utilizados e dos métodos de deteção podem ser encontrados neste trabalho.
- Teste Pré-natal não invasivo(NIPT - Non-Invase Pre-Natal Test)Publication . Marques, Adriana Isabel BarrosO diagnóstico pré-natal tem como objetivo a deteção precoce de anomalias cromossómicas, mas apenas é possível por meio de métodos de diagnóstico invasivos que acarretam o risco de perda fetal. A descoberta de ADN fetal livre na circulação materna, veio impulsionar o desenvolvimento de um teste pré-natal não invasivo (NIPT). Este trabalho teve como objetivo fazer uma revisão da literatura sobre o atual estado da arte do NIPT. Para tal, foi feita uma pesquisa bibliográfica no PUbMed, da qual foram selecionados os artigos de interesse. Atualmente, o NIPT pode ser utilizado com confiança no rastreio pré-natal das aneuploidias mais comuns. Para tal, são utilizadas as tecnologias de sequenciação de nova geração, através de diferentes abordagens. Estudos confirmaram uma elevada sensibilidade do NIPT em relação aos testes de rastreio bioquímico. Contudo, existem limitações que fazem ainda com que este teste não possa ser considerado um teste de diagnóstico, carecendo de confirmação através de um teste invasivo. Apesar de ser dispendioso, o NIPT encontra-se já implementado na prática clínica de diversos países, não sendo ainda disponibilizado pelo Sistema Nacional de Saúde em Portugal. Apesar de ter revelado várias potencialidades, existe ainda um caminho a percorrer para que possa ser uma alternativa aos métodos de diagnóstico convencionais.
- Doença trofoblástica gestacional diagnóstico citogenético e molecular da displasia mesenquimatosa não-molarPublication . Miranda, Diana Catarina Pinto; Nogueira, Rosete; Torres, Fátima; Granja, Sara CostaA Doença Trofoblástica Gestacional (DTG) é um grupo de tumores raros relacionados com a gravidez morfologicamente caracterizada pela proliferação trofoblástica anormal. O diagnóstico é suspeitado pela elevação serológica de hCG e pelos achados na ultrassonografia pélvica sendo que, o diagnóstico definitivo é histológico. Este estudo tem como objetivo principal a caracterização das alterações citogenéticas moleculares na Displasia Mesenquimatosa Não-Molar (DM-NM) da placenta. Adicionalmente, Avaliamos a frequência da DTG e a concordância dos diagnósticos patológicos e genéticos. Para isso, foi realizado um estudo retrospetivo longitudinal de relatórios patológicos de amostras de aborto espontâneo do 1º trimestre e de placentas do 2º e 3º trimestre no período compreendido entre 1 de outubro de 2007 e 31 de dezembro de 2020, realizado num centro diferenciado em patologia embriofetal e placentar. O estudo sistemático dos produtos de aborto, nomeadamente do aborto precoce, permitiu por um lado uma maior deteção de casos de DTG, nomeadamente da mola hidatiforme (MH) em particular da MH completa precoce (MHC-P), e por outro promoveu o aperfeiçoamento dos critérios em casos de difícil diagnóstico como é a Displasia Mesenquimatosa Não-Molar (DN-M). Estudos genéticos adicionais melhoraram a identificação de contextos sindrómicos.
- DGCR8 microprocessor defect and deregulation of its expression in thyroid lesionsPublication . Rodrigues, Lia Cristiana Gomes; Vinagre, João Pedro Rico de Oliveira; Ferreira, Ana Paula Soares Dias; Silva, Regina Augusta Alves Pereira daDeregulation of microRNA (miRNA) processing is a driver event in several tumors including thyroid cancer. DiGeorge Critical Region 8 (DGCR8) gene holds a critical role in miRNA biogenesis, as a microprocessor complex componente, and in the development of the thyroid. Previous studies identified DGCR8mutation – the variant c.1552G˃Ap.(E518K) – in cases of thyroid cancer and proposed to cause a familial syndrome characterized by multinodular goitre (MNG) and schwannomatosis. The goal of this study was to characterize the variant p.(E518K) of DGCR8 in thyroid lesions and evaluate its expression. A series of thyroid lesions were evaluated by sequencing fot the c.1552G˃Ap.(E518K) variant. When frozen tissue was available, DGCR8 mRNA expression was analysed by qPCR. Formalin-fixed parafin-embedded tissues were studied for DGCR8 immunoexpression. In this work, i tis decribed for the first time the hotspot p.(E518K) mutation in a case poorly differentiated thyroid carcinoma. This case displayed DGCR8 mRNA expression comparable to the basal level whereas the protein expression was highly aberrant. Deregulation of folicular.patterned tumours was also observed at the DGCR8 mRNA level. The obtained data suggest that DGCR8 could have a role in thyroid tumorigenesis, particularlyin folicular-patterned thyroid tumours.
- Diagnóstico assistido por computador no Cancro Colorretal: podemos fazê-lo?Publication . Ribeiro, Liliana Filipa Pinho; Cardoso, Jaime; Silva, Regina Augusta Alves Pereira daO número de casos de cancro colorretal tem aumentado exponencialmente, fazendo desta doença oncológica uma das mais diagnosticadas mundialmente. No entanto, o número de patologistas disponíveis para a realização do diagnóstico mantem-se constante, o que leva a um aumento da carga de trabalho destes profissionais, bem como a um aumento no tempo de resposta ao doente. É, desta forma, urgente a criação de ferramentas que ajudem os patologistas a gerir mais eficazmente o seu trabalho. A aplicabilidade crescente da patologia digital e os correntes avanços na tecnologia, fazem do diagnóstico assistido por computador uma ferramenta promissora na patologia. Este trabalho teve como objetivos a criação de uma base de dados de amostras colorretaisa ser usada para treinar um algoritmo de deep learning para o diagnóstico de amostras colorretais, e a avaliação da precisão desse algoritmo. Foi construída uma base de dados com 10% das imagens anotadas. Com esta base foi possível fazer dois eventos de treino e teste do algoritmo, com um número crescente de amostras. Foram utilizadas três categorias de diagnóstico: benigno, lesão de baixo grau e lesão de alto grau. Para cada evento foi possível atingir uma precisão de 88,42% e 89,89%, respetivamente. Para o diagnóstico diferencial entre benigno e lesão obteve-se uma precisão de 96%. Apesar de ainda existirem algumas barreiras à implementação desta tecnologia na rotina patológica, o diagnóstico assistido por computador demonstra o potencial de auxiliar os patologistas numa mais eficaz gestão da sua carga laboral.
- Implementation of molecular techniques for the neonatal sreening of spinal muscular atrophyPublication . Carneiro, Paula Renata Oliveira; Rocha, Hugo Daniel Carvalho de Azevedo; Granja, Sara da CostaSpinal muscular aptrophy (SMA) is neurodegenerative disease mainly caused by the homozygous deletion of the functional tolemeric survival motor neuron 1 gene (SMN1) exon 7. This absence causes a lack of the ubiquitous SMN protein wich, in turn, selectively destroys alfa motor neurons. Due to the disease severity, i tis the leading genetic cause of infant death. The copy number of the centromeric SMN2 gene has na inverse correlation with the phenotype. SMA is currently classified in 5 types – Type 0 (lethal in womb or in th first weeks of life), Type 1 (that counts for the majority of cases), Type 2 (children can sit alone), Type 3 (children can walk independently) and Type 4 (mildest from that appears in dults). Diagnosis i only made when symptoms arise and by that time motor neurons are already irreversibly loss. Three therapies are now available but they are most effective in the asymptomatic phase. To achieve this objective, the strategy is to include SMA in the panel of diseases screened in the Neonatal Screening Programs. In this sense, we describe the implementation of na assay, based on reagentes prepared in house, that detects the absence of exon7 of the SMN1gene through the real-time polymerase chain reaction (qPCR) technique, adapted to Neonatal Screening. Samples used were from the dried blood spots of the already implemented Guthrie cards on the newborn screening. This method is a reliable, simple and affordable way to screen for this lethal disease.
- Transcripts as modifiers of phenotypic variability in hereditary transthyretin-mediated amyloidosis biopsiesPublication . Gouveia, Ana Maria Furtado; Ferreira, Miguel Alves; Cirnes, Luís; Granja, SaraHerditary transthyretin-mediated amyloidosis (ATTRv) is a severe disease, dominat, autosomal amyloidois characterized by a progressive polyneuropathy, due to a point mutation in TTR gene, causing the deposition of amyloid fibrils in peripheric nerves. Due to wide variability in age-at-onset (AO), two main groups were stablished, early-onset (AO˂50 years) and late-onset (AO≥50 years). The main goal of this project was the analysis of RNA transcripts theta could act as modifiers of phenotypic variablility in ATTRv patient biopsies. Therefore, it was stablished wo main steps: (A) extraction and quantification of RNA from paraffin biopsies and (B) analysis of RNA transcripts that will allow to explain phenotypic variability in ATTRv. Five differentially expressed genes were identified in salivar gland samples. MGAM2 gene stood out between the other four genes due to its higher expression in the early AO group. This gene may be associated with the inhibition of a protectice factor that was not identified yet. Overall, our study may be a precursor to future exploration of proein-protein interactions, as well as the SNPs detection in differentially expressed genes that may modulate the phenotypic variability in ATTRv.
- Análise e gânglios sentinela em cancro da mama: O papel do ensaio OSNA® na caracterização das micrometástases e macrometástasesPublication . Teixeira, Catarina Oliveira; Silva, Regina Augusta Alves Pereira da; Vieira, Ana Filipa QuintelaEm 2020, o cancro da mama foi o tumor maligno com maior incidência mundial e o segundo mais letal. O OSNA® classifica a presença de metástases no gânglio sentinela como micrometástases ou macrometástases. Este método apresenta alta sensibilidade e especificidade e permite auxiliar a decisão terapêutica de realizar ou não o esvaziamento ganglionar axilar, com o objetivo de diminuir a morbilidade associada. O principal objetivo deste trabalho foi conhecer a realidade dos casos em que se realizou OSNA® no Hospital Pedro Hispano, analisar e interpretar os dados para implementar melhorias nos procedimentos. Um total de 79 pacientes com metástases no gânglio sentinela detetadas pelo OSNA® foram incluídas no estudo. A análise permitiu confirmar que o OSNA® é uma metodologia segura na deteção de metástases ganglionares quando comparada à técnica convencional, principalmente para a deteção de micrometástases. No entanto, não se verificou nenhum padrão que determinasse um perfil característico do tipo de metastização do gânglio sentinela pelo OSNA®. Um estudo futuro que integre todas as pacientes com cancro da mama que realizaram o ensaio molecular OSNA® permitirá compreender melhor os perfis clínicos e anatomopatológicos dos tumores associando ao resultado do OSNA®.