ESS - DM - Bioquímica em Saúde
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- Abordagem laboratorial no diagnóstico e follow-up de gamapatias monoclonais - uma comparação de métodosPublication . Pereira, Ana Isabel Nogueira; Calle, Maria; Vieira, MónicaAs discrasias de plasmócitos constituem um grupo de desordens malignas e pré-malignas caracterizadas pela produção de proteínas monoclonais, chamadas M-Proteína. A sua concentração pode variar de algumas mg/L de cadeias leves livres (CLL) no soro a g/L de imunoglobulinas monoclonais completas. O doseamento de CLL em circulação é essencial no diagnóstico, prognóstico e avaliação da resposta aos tratamentos. O desenvolvimento de novos métodos de quantificação de CLL tornou-se especialmente interessante porque representa o marcador tumoral de eleição diretamente relacionado com a fisiopatologia da doença. O primeiro método de doseamento foi desenvolvido em 2001 e caracterizou-se por um ensaio baseado em nefelometria ou turbidimetria usando anticorpos policlonais. Posteriormente surgiu um novo método utilizando anticorpos monoclinais e com ele a necessidade de comparar os dois métodos, as suas limitações e utilidades no diagnóstico laboratorial. A análise de dados mostra que o Atellica NEPH 630 obtém resultados mais concordantes para CLL Kappa (comparado com o método de referência) enquanto para a CLL Lambda o equipamento DxC 700 AU obtém maior concordância.
- Actomyosin regulation in the germline versus somatic gonad in C. elegansPublication . Silva, Hugo Manuel Freitas Sousa e; Osório, Daniel Sampaio; Carvalho, Ana Xavier de; Ferraz, RicardoThe gonad of an adult hermaphrodite of Caenorhabditis elegans is an excellent model system for studying the processes related to actomyosin contractility. In a previous study in our lab we analysed the depletion of 135 genes related to actomyosin networks, with the aim to characterize phenotypes in the gonad. This study identified a group of 25 genes whose depletion caused the formation of diffuse DNA masses in the oocytes and / or in the uterus (Emo phenotype). The experimental work of this thesis focused on determining whther these Emo phenotypes were due to rolos in the somatic or germline gonad. For this purpose we used starins od C. elegans where RNA interference is triggered specificaly in somatic or germ cells and we analyzed the number of progeny and embryonic viability. To characterize in more detail the effects on the gonad morphology, we combined high resolution microscopy in real time wiyh the ability to specifically deplete proteins in the somatic or germ cells. We found that the anillin ANI-1, whose depletion leads to Emo phenotype, predominantly affects the somatic gonad.
- ADP-ribosylation of host cell proteins in salmonella infectionPublication . Pinto, Rita Gil Fernandes; Miettinen, Moona; Pulliainen, Arto; Prudêncio, CristinaADP-ribosylation is a reversible enzymatic post-translational modification consisting in the transfer of one or many ADP-ribose residues from NAD+ to a target protein. ADPribosylation signalling has been linked to cancer and immune responses. Many bacterial protein toxins have been identified to act through ADP-ribosylation of protein targets inside the host cell. This project is based on a hypothesis that endogenous host cell poly-(ADPribose) polymerases (PARPs) become activated in bacterial infection and ADP-ribosylate specific host cell proteins to influence pathogen clearance. Mono- and poly-(ADP-ribose)-specific Western blotting was first used to detect ADPribosylated proteins during Salmonella infection and lipopolysaccharide (LPS) or cytokine stimulation of different cell types. Multiple ADP-ribosylated proteins originating either from host cell or the invading Salmonella was detected. It was found that, similarly to Salmonella infection, LPS induced ADP-ribosylation of the host cell proteins. Cytokines did not induce ADP-ribosylation of the host cell proteins. Macrophages displayed more robust changes in ADP-ribosylated proteins as compared to epithelial cells. Secondly, quantitative PCR and Western blotting were used to quantify expression levels of PARPs during Salmonella infection and LPS or cytokine stimulation of different cell types. It was detected one protein to be mono-ADP-ribosylated in both epithelial cells and macrophages. Macrophages showed two additional signals identified as poly-ADP-ribosylation. LPS stimuli in macrophages showed proteins poly-ADP-ribosylated at similar size of one found in bacterial infection. Cytokines did not induce ADP-ribosylation in macrophages. In epithelial cells both LPS and cytokines showed to increase expression of PARP1, while Salmonella had no effect in its expression, whereas in macrophages, PARP1 had different expression by stimuli of bacteria and cytokines but LPS had no effect. As for PARP14 expression in epithelial cells, LPS and TNFα had no effect in its expression however, it showed changes in expression when incubated with the interferons and Salmonella. In macrophages, TNFα remained to have no effect in PARP14 expression while all the other caused differential expression of the enzyme. Lastly, stimulation with bacteria or LPS and IFNγ led to changes in expression values of parp1 and parp14. In conclusion, endogenous host cell PARPs become upregulated, activated and ADPribosylated host cell proteins in Salmonella infection. These changes might benefit the invading bacterium or the human host cells. The results provide the basis for future experimentation on the importance of PARPs and ADP-ribosylation in bacterial infection. This knowledge may allow the development of targeted therapeutic strategies for emerging antibiotic resistant bacteria, potentially involving PARP targeting.
- Alterações da sinalização purinérgica gastrointestinal na DiabetesPublication . Monteiro, Ana Salomé GonçalvesA dismotilidade entérica é uma complicação a longo prazo da Diabetes mellitus (DM) que causa desconforto significativo em 76% dos pacientes diabéticos. Sabendo que as purinas estão envolvidas na neuromodulação colinérgica e que no SNC de animais diabéticos foram encontradas alterações na expressão de recetores purinérgicos, decidimos investigar se na dismotilidade diabética a neuromodulação purinérgica se encontra preservada. O modelo animal escolhido de diabetes tipo I resultou da administração de estreptozotocina (STZ, 55 mg/kg, IP) a ratazanas (Rattus norvegicus, Wistar). Este modelo STZ provou ser adequado para o estudo, apresentando 2 semanas após a indução polidipsia, poliúria, polifagia, hiperglicemia e um atraso da motilidade gastrointestinal. A caraterização morfológica macroscópica dos animais STZ revelou um aumento significativo do cego e do intestino. Funcionalmente, estudos preliminares indicam que as contrações espontâneas do íleo dos animais STZ perdem ritmicidade e apresentam maior amplitude que as dos animais controlo de uma forma insensível à TTX, sugerindo o comprometimento das ICC. Paralelamente, estudos imagiológicos revelaram uma perda neuronal mioentérica, principalmente de neurónios nitrérgicos, sendo os colinérgicos preservados. Contudo, a resposta muscular do íleo de animais diabéticos à acetilcolina (ACh) foi inferior à dos controlos, estando a libertação de ACh modulada pela adenosina modificada. Verificou-se que a inibição promovida pelos recetores A1 se mantinha, mas que se perdia a facilitação mediada pela ativação de recetores A2A, cuja imunorreatividade também se encontrava diminuída. Curiosamente, apesar do catabolismo do ATP e dos seus metabolitos estar aumentado nos animais STZ, não se verificou um aumento dos níveis extracelulares de adenosina. Nos animais diabéticos a adenosina é rapidamente desaminada e recaptada por transportadores de nucleósidos, com principal relevância para os concentrativos, sendo os equilibrativos responsáveis pelo transporte da adenosina em animais controlo. Os resultados apresentados nesta tese sugerem que a dismotilidade diabética pode dever-se à perda da atividade nitrérgica, das ICC e da neuromodulação purinérgica mediada por recetores A2A, comprometendo assim a libertação de ACh e consequentemente a motilidade GI.
- Alzheimer´s disease: assessing the therapeutic potential of Marine cyanobacteriaPublication . Hamuzá, Ana Catarina de Andrade; Martins, Rosário; Reis, Mariana; Vieira, MónicaAlzheimer’s disease (AD) is a chronic neurodegenerative disease with a multifactorial nature, that affects more than 50 million people worlwide and is the most common cause of dementia among older adults. Due to its crescent prevalence and devastating life consequences, continuous efforts have been made to better understand. AD’s biological causes and discover novel therapeutics that can give a proper therapeutic answer to this neurodegenerative condition. Available therapeutic options can only ameliorate symptoms and sometimes cause additional side effetcs. Cyanobacteria are a rich source of interesting secondary metabolites and bioactive compounds with beneficial properties and an array of diferente applications. In this light, we aim toasses the therapeutic potential of 96 fractions of cyanobacterial methanolic extracts based on cytotoxicity in the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line, in the fibroblastos 3T3L1 cell line, and in the brain microvascular endotelial hCMEC/D3 cell line, and acetylcholinesterase (AChE) inhibition activity. Four fractions, in the MTT assay, showed cytotoxicity on neuroblastoma cell lines, fibroblastos, and endotelial cells. The fractions of the cuanobacteria strains Oxynema acuminatum LEGE 06072B and C, Synechocystis salina LEGE 06155 A and B, and Cyanobium sp. LEGE 07175 E, F, and G, demonstrated the most promising results in relation to AChE inhibition activity with inhibition percentages of 38.37%; 43.03%; 32.17%; 30.75%;36.91%; 34.65% and 34.12%, respectively, showing no cytotoxic effects on SH-SY5Y, 3T3-L1 and hCMEC/D3 cell lines. These are also the cyanobacteria strains that revealed the best extraction yields, of 18.250%, 17.804% and 21.047%, respectively. According to the results, cyanobacteria represente significant promise for new therapeutic approaches for AD, however, more studies are needed to deepen the understanding of the therapeutic poential of these microorganisms.
- Análise do polimorfismo HLA/DR-DQ em Angolanos portadores de Diabetes Mellitus tipo IPublication . Ramos, Nilda; Fernandes, RúbenA diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é o distúrbio endócrino-metabólico mais frequente em crianças. É uma doença autoimune resultado da destruição selectiva das células beta pancreáticas. A velocidade de destruição das células beta pode ser rápida em algumas pessoas e lenta em outras; esta última é típica de adulto é conhecido como diabetes autoimune latente em adulto (LADA). A sua etiologia envolve factores ambientais e genéticos, dos genes envolvidos a maior contribuição vem da região do genoma onde estão localizados os genes do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC). A combinação de diferentes alelos do sistema de antigénio leucocitário humano tipo II (HLAII) esta associada a susceptibilidade da doença e as principais molécula envolvidas são a DQ e DR. O estágio pré-clínico da doença se caracteriza pela presença de auto-anticorpos, sendo o anti-GAD o mais sensível nesta patologia. OBJECTIVO: Analizar a frequência dos polimorfismos HLA-DR/DQ em angolanos portadores de diabetes tipo 1, residentes em Luanda. O tipo de estudo adotado foi casocontrolo num universo de voluntários provenientes da consulta externa de hospitais e clínicas locais no período de outubro de 2012 a outubro 2013. A amostra biológica utilizada foi sangue total, tendo sido processada no laboratório LABGENE, da Faculdade de Medicina (FM) da Universidade Agostinho Neto (UNA). Os auto-anticorpos, anti-GAD, foram doseados pelo método de ELISA. O ADN genómico foi extraído à partir de sangue total periférico e tipagem genética foi realizada mediante PCR-SSP.O alelo DQB1*02 (DQ2/DQ2) (p=0,033, OR= 4, IC (1,2-13,3) foi associado a susceptibilidade da DM1; os alelos DQB1*06 (DQ6/DQ6) (p=0,000, OR=0,30, IC (0,17-0,54); *11 (p=0,011, OR=0,14, IC=0,032-0,62); *13 (p=0,006, OR=0,13, IC=0,049-0,588) e *15 (p=0,001, OR=0,044, IC=0,005-0,39) foram associados a proteção. Foi encontrado 29,2% de positividade para o anti-GAD, não houve associação significativa (p=0,69) entre a resposta positiva do anti-GAD e a idade. Não foi encontrada associação significativa (p=0,39) entre o tempo de diagnóstico e resposta humoral. Observou-se associação significativa entre os alelos de risco DQB1*02 (p=0.000) e resposta positiva para anti-GAD; da mesma maneira houve uma associação significativa para os alelos DQB1*06 (p=0,002), DRB1*11 (p=0,048); *13 (p=0,004) e *15 (p=0,021) e a resposta negativa do anti-GAD.Os dados demostram o forte envolvimentos do gene HLA-II (DQ) com a suceptibilidade a DM1 e sugere que a autoimunidade se desenvolve na presença de susceptibilidade genética, quer dizer, em associação com alelos HLA-II específicos.
- Angiogenesis in schistosomiasis: contribution to cancer and diseasePublication . Dematei, Anderson; Fernandes, Rúben; Botelho, Mónica C.Introdução: A schistosomose é uma Infeção associada a ovos de Schistosoma em tecidos. Os antigénios libertados pelo ovo estimulam uma reação granulomatosa envolvendo linfócitos, macrófagos e eosinófilos que resultam em doença clínica Schistosomose é considerada a segunda doença parasitária, a seguir à malária no mundo. Os seus agentes etiológlcos estão relacionados ao processo carcinogénico na bexiga e à fibrose no fígado. Avanços recentes nos campos da biologia molecular e epidemiologia levaram a demonstrações significativas para esclarecer a relação entre agentes Infeciosos e cancro e forneceram informações valiosa sobre a base molecular da carcinogénese Objetivos: Neste sentido. para melhor compreender estes mecanismos, avaliamos o papel da inflamação (IL-6), angiogénese (CD31), linfagiogénese (LYVE-1) e metabolismo (glicogénio) (LYVE-1) num modelo animal Infetado com S mansoni mediante ensalmos histoquímicos, histoenzimáticos e Imunohistoquímicos. Resultados: Os resultados obtidos neste estudo indicam que a schistosomose Influencia a libertação de fatores pró-inflamatórios como IL-6 em quantidades significativas para o fígado. o que pode estar relacionado à quantidade de granulomas obtidos na análise histológica do tecido. A expressão de CD31 demonstrou uma quantidade significativa a MVD que está diretamente relacionada com angiogénese. A expressão de LYVE 1 no fígado e baço, quando comparados aos controles, indica um aumento da linfangiogénese. Os granulomas apresentaram grandes quantidades de matriz fibrótica e promoveram uma diminuição significativa de glicogénio no tecido infetado . Conclusão: A infeção causada por S. mansoni aumenta a inflamação linfa/anglogénese e influencia os processos metabólicos celulares para a manutenção e ou desenvolvimento do parasita e para uma resposta tecidular. onde a neovascularização detém um papel central.
- Assessment of guanylin peptides system in type 2 diabetesPublication . Silva, Liliana; Maia, Maria Benedita SampaioOs doentes com diabetes mellitus tipo 2 apresentam predisposição para a retenção de sódio e são frequentemente hipertensos. No entanto, os mecanismos implicados na dificuldade do rim diabético em mobilizar o sódio são, ainda, pouco compreendidos. Os peptídeos da família das guanilinas estão envolvidos na regulação do transporte de electrólitos e água nos epitélios intestinal e renal, através da activação do receptor guanilato ciclase-C (GC-C) e subsequente libertação intracelular de GMPc. O objectivo do presente estudo foi a avaliação da actividade do sistema dos peptídeos das guanilinas (SPG) e do seu papel na regulação do balanço de sódio num modelo animal de diabetes tipo 2. Ratinhos machos C57BL/6 foram submetidos a uma dieta com alto teor de gordura e rica em hidratos de carbono simples (ratinhos diabéticos) ou a uma dieta normal (ratinhos controlo). A expressão renal e intestinal da guanilina (GN), uroguanilina (UGN) e do receptor GC-C assim como os níveis de GMPc na urina e plasma foram avaliados nos ratinhos controlo e diabéticos, durante a ingestão de dietas normo (NS) e hiper-salina (HS). Nos ratinhos diabéticos, durante a dieta NS verificou-se um aumento significativo da pressão arterial que foi acompanhado de redução da expressão do ARNm da GN, UGN e do GC-C no intestino e de aumento da expressão de ARNm da UGN no rim. A dieta HS induziu um aumento da expressão do ARNm da UGN no jejuno dos ratinhos controlo mas não nos diabéticos. Os ratinhos diabéticos apresentaram níveis urinários de GMPc inferiores aos controlos, em condições de dieta NS. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que na diabetes tipo 2 ocorre uma redução da actividade intestinal do SPG que é acompanhada por um aumento compensatório da actividade renal do SPG. A diminuição da actividade do SPG intestinal na diabetes tipo 2 deve-se não só a uma redução da expressão dos peptídeos GN e UGN, mas também a uma redução da expressão do seu receptor, GC-C. Estes resultados sugerem que o SPG pode contribuir para a sensibilidade ao sódio na diabetes.
- Associação entre polimorfismo inserção/delecção da enzima conversora da angiotensina na diabetes mellitus tipo 2: estudo da população portuguesaPublication . Silva, Ana Luísa; Fernandes, RúbenA Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é uma patologia de etiologia múltipla à qual estão associados vários factores genéticos. A Enzima Conversora da Angiotensina (ECA) tem sido alvo de vários estudos pela sua relação com factores pró-inflamatórios, pró-oxidantes e pró-fibrose, sendo o polimorfismo de Inserção/Delecção o mais estudado. Neste contexto, o objectivo deste estudo é assim verificar a distribuição deste polimorfismo numa amostra de indivíduos de nacionalidade portuguesa e verificar a sua possível associação com a DM2. Para tal, foram analisadas 87 amostras (controlos n =24 e diabéticos n =63) de indivíduos de nacionalidade portuguesa. As amostras foram submetidas a um processo de extracção de ADN, sendo posteriormente amplificadas por Polymerase Chain Reaction e analisadas por eletroforese em gel de agarose a 1%. Observou-se uma prevalência de 8% (n=7) com genótipo I/I, 38% (n=33) com genótipo I/D e 54% (n=47) com genótipo D/D. A amostra em estudo demonstrou assim estar sob o equilíbrio Hardy-Weinberg. Observou-se também uma associação entre níveis mais elevados de glicemia e o genótipo I/I (p=0,019). Na análise da utilização de insulina no controlo dos níveis de glicemia na DM2, observou-se uma maior proporção de indivíduos com genótipo D/D. Este estudo demonstra a importância do investimento da caracterização genética em patologias metabólicas multifactoriais como a DM2.
- Auditorias técnicas no laboratório de química clássica da Silliker PortugalPublication . Vieira, Ana Isabel da Rocha Neto; Vieira, MónicaOs objetivos estabelecidos ppara este estágio foram: i) a aquisição de conhecimento relativamente à norma ISO/IEC 17025:2005, pela qual os laboratórios da empresa são acreditados pelo IPAC, e, ii) obtenção de competências para a realização de auditorias técnicas aos métodos de análise química acreditados e não acreditados do laboratório Química Clássica. Devido à crescente competitividade no setor, utilização de créditos rigorosos de controlo da qualidade, bem como aplicação de sistemas de gestão e constante globalização, tornou-se imperativo que a Sikiller organizasse os seus laboratórios e restantes departamentos segundo um conjunto de princípios e requisitos que constituem a norma ISO/IEC 17025:2005. Desta forma, a empresa transmite aos seus clientes mais confiança e rigor na prestação dos seus serviços, permitindo também harmonizar normas/procedimentos e facilitando a cooperação entre laboratórios e outras empresas. Um dos parâmetros dos requisitos de gestão da norma ISO/IEC 17025:2005 é a realização de auditorias técnicas anuais, de forma a verificar se o desempenho dos ensaios satisfazem os requisitos exigidos pela presente norma, permitindo também rastrear os ensaios a nível do controlo da qualidade (como realização de DPCS (Daily Process Control Samples - Amostras Diárias de Controlo de Processos); realização de amostras em duplicado por cada 5 a 10% do total de amostras; verificação e calibração de equipamentos; participação em ECI´s (Ensaios de Comparação Interlaboratorial); entre outros. Através das auditorias técnicas é possível a constatação de não conformidades, implementação de ações corretivas e identificação de oportunidades de melhoria.