ESS - DM - Bioquímica em Saúde
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Browsing ESS - DM - Bioquímica em Saúde by Field of Science and Technology (FOS) "Ciências Médicas::Ciências da Saúde"
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- Alterações da sinalização purinérgica gastrointestinal na DiabetesPublication . Monteiro, Ana Salomé GonçalvesA dismotilidade entérica é uma complicação a longo prazo da Diabetes mellitus (DM) que causa desconforto significativo em 76% dos pacientes diabéticos. Sabendo que as purinas estão envolvidas na neuromodulação colinérgica e que no SNC de animais diabéticos foram encontradas alterações na expressão de recetores purinérgicos, decidimos investigar se na dismotilidade diabética a neuromodulação purinérgica se encontra preservada. O modelo animal escolhido de diabetes tipo I resultou da administração de estreptozotocina (STZ, 55 mg/kg, IP) a ratazanas (Rattus norvegicus, Wistar). Este modelo STZ provou ser adequado para o estudo, apresentando 2 semanas após a indução polidipsia, poliúria, polifagia, hiperglicemia e um atraso da motilidade gastrointestinal. A caraterização morfológica macroscópica dos animais STZ revelou um aumento significativo do cego e do intestino. Funcionalmente, estudos preliminares indicam que as contrações espontâneas do íleo dos animais STZ perdem ritmicidade e apresentam maior amplitude que as dos animais controlo de uma forma insensível à TTX, sugerindo o comprometimento das ICC. Paralelamente, estudos imagiológicos revelaram uma perda neuronal mioentérica, principalmente de neurónios nitrérgicos, sendo os colinérgicos preservados. Contudo, a resposta muscular do íleo de animais diabéticos à acetilcolina (ACh) foi inferior à dos controlos, estando a libertação de ACh modulada pela adenosina modificada. Verificou-se que a inibição promovida pelos recetores A1 se mantinha, mas que se perdia a facilitação mediada pela ativação de recetores A2A, cuja imunorreatividade também se encontrava diminuída. Curiosamente, apesar do catabolismo do ATP e dos seus metabolitos estar aumentado nos animais STZ, não se verificou um aumento dos níveis extracelulares de adenosina. Nos animais diabéticos a adenosina é rapidamente desaminada e recaptada por transportadores de nucleósidos, com principal relevância para os concentrativos, sendo os equilibrativos responsáveis pelo transporte da adenosina em animais controlo. Os resultados apresentados nesta tese sugerem que a dismotilidade diabética pode dever-se à perda da atividade nitrérgica, das ICC e da neuromodulação purinérgica mediada por recetores A2A, comprometendo assim a libertação de ACh e consequentemente a motilidade GI.
- Bioatividade de Líquidos Iónicos Derivados do Valproato na Osteoclastogénese Humana e Estudo do Efeito Antomicrobiano dos Catiões UtilizadosPublication . Joana Alves dos Santos CorreiraOs Líquidos Iónicos (LIs) são compostos iónicos com pontos de fusão abaixo de 100°C, muitos deles são líquidos à temperatura ambiente. As numerosas combinações entre o catião e anião permitem modular as suas propriedades físico-químicas. A associação entre LIs e Ingredientes Farmacêuticos Ativos (IFAs) tem sido estudada e revelou que esta combinação reduz os efeitos secundários dos fármacos e aumenta a sua biodisponibilidade. A resistência bacteriana é um problema na sociedade moderna. Por esse motivo, é crucial pesquisar novos alvos terapêuticos para superar esta situação. O Ácido Valpróico (VPA) é um fármaco anti-epiléptico muito utilizado no tratamento de doenças neurológicas, mas que possui vários efeitos secundários associados, afetando principalmente a remodelação óssea. A combinação de LIs e IFAs – LIs-IFAs – tem demostrado que estes compostos podem ser úteis para ultrapassar a resistência bacteriana, bem como os problemas que os pacientes sujeitos ao tratamento com VPA experienciam. O objetivo deste estudo é determinar a bioatividade de LIs-IFAs, tanto em estirpes de bactérias, como em células do osso – osteoclastos (humanos). No estudo bacteriano, a Ampicilina de Sódio e vários catiões halogenados foram aplicados em estirpes bacterianas, nas quais estavam incluídas algumas estirpes resistentes, e foram determinadas as suas taxas de crescimento. No estudo osteoclastogénico, foram usados vários catiões associados com valproato que, posteriormente, foram aplicados em culturas de células osteoclásticas humanas para determinar o seu efeito nestas células. Os LIs-IFAs mostraram efeitos inibitórios em ambos os estudos. No estudo antimicrobiano o [C16Pyr] [Cl] associado à Ampicilina de Sódio revelou inibição das estirpes sensíveis e de bactérias resistentes. Na avaliação do processo osteoclastogénico, o [C2OHDMIM] [Valproato] e [C6,6,6,14P] [Valproato] demonstraram capacidade de modular negativamente este processo. Os resultados obtidos no presente trabalho destacam o potencial destes compostos como novos fármacos, e a importância de outros estudos para compreender os mecanismos pelos quais eles atuam, tanto em células como em bactérias.
- Biomarkers of Nitrosative Stress: Development and validation of a new analytical method for 3-Nitrotyrosine quantificationPublication . Dulce Liliana Ribeiro TeixeiraBackground: The nitration of tyrosine residues in proteins is associated with nitrosative stress, resulting in the formation of 3-nitrotyrosine (3-NT). 3-NT levels in biological samples have been associated with numerous physiological and pathological conditions. For this reason, several attempts have been made in order to develop methods that accurately quantify 3-NT in biological samples. Regarding chromatographic methods, they seem to be very accurate, showing very good sensibility and specificity. However, accurate quantification of this molecule, which is present at very low concentrations both at physiological and pathological states, is always a complex task and a target of intense research. Objectives: We aimed to develop a simple, rapid, low-cost and sensitive 3-NT quantification method for use in medical laboratories as an additional tool for diagnosis and/or treatment monitoring of a wide range of pathologies. We also aimed to evaluate the performance of the HPLC-based method developed here in a wide range of biological matrices. Material and methods: All experiments were performed on a Hitachi LaChrom Elite® HPLC system and separation was carried out using a Lichrocart® 250-4 Lichrospher 100 RP-18 (5μm) column. The method was further validated according to ICH guidelines. The biological matrices tested were serum, whole blood, urine, B16 F-10 melanoma cell line, growth medium conditioned with the same cell line, bacterial and yeast suspensions. Results: From all the protocols tested, the best results were obtained using 0.5% CH3COOH:MeOH:H2O (15:15:70) as the mobile phase, with detection at wavelengths 215, 276 and 356 nm, at 25ºC, and using a flow rate of 1 mL/min. By using this protocol, it was possible to obtain a linear calibration curve (correlation coefficient = 1), limits of detection and quantification in the order of ng/mL, and a short analysis time (<15 minutes per sample). Additionally, the developed protocol allowed the successful detection and quantification of 3-NT in all biological matrices tested, with detection at 356 nm. Conclusion: The method described in this study, which was successfully developed and validated for 3-NT quantification, is simple, cheap and fast, rendering it suitable for analysis in a wide range of biological matrices.
- Caracterização de comportamentos de nocicepção, ansiedade e depressão em dois modelos de dor neuropática em ratinhoPublication . Gonçalves, Marta Sofia Ferreira; Neto, Fani Lourença Moreira; Martins, Maria Isabel Torres; Prudêncio, CristinaA dor neuropática resulta de uma lesão nos sistemas nervoso central ou periférico. É uma condição crónica de elevada prevalência, que pode promover estados patológicos como depressão e ansiedade. Reciprocamente, perturbações do humor podem também intensificar a experiência dolorosa. A fisiopatologia da dor neuropática é de natureza complexa, multifatorial e não está completamente elucidada. Este projeto teve três objetivos principais: 1) A implementação, validação e caracterização de dois modelos de dor neuropática em ratinho; 2) A otimização de protocolos experimentais que permitam realizar os testes de ansiedade ou depressão no biotério da Instituição de forma a futuramente transpor este tipo de estudo a animais transgénicos; 3) A avaliação de comportamentos indicativos de ansiedade e/ou depressão nos dois modelos de dor. Foram induzidos dois modelos de dor neuropática em ratinhos C57BL/6, nomeadamente o modelo de neuropatia diabética por injeção de estreptozotocina (modelo STZ) e um modelo de lesão traumática de nervos periféricos (SNI ou spared nerve injury). O desenvolvimento da patologia e a hipersensibilidade a estímulos inócuos e nóxicos foi avaliado pelos testes de von Frey em ambos os modelos. Ambos os modelos apresentaram alodínia mecânica. Posteriormente, foram avaliados comportamentos indicativos de estados de ansiedade e/ou depressão em ambos os modelos, não tendo sido observadas diferenças significativas. Avaliou-se se a execução prévia de testes nociceptivos poderia influenciar os resultados da avaliação da ansiedade e/ou da depressão. Observaram-se diferenças significativas entre o grupo experimental submetido a avaliação nociceptiva previamente e o grupo somente avaliado para ansiedade e depressão, em todos os testes à exceção do teste marble burying. No modelo SNI também foi avaliada, por imunohistoquímica, a ativação de proteínas cinases 1 e 2 reguladas por sinais extracelulares (ERK 1/2). Verificou-se forte ativação de áreas encefálicas envolvidas no processamento afetivo da dor, nomeadamente no córtex cingulado anterior e na amígdala. Este projeto permitiu a implementação, caracterização e otimização de protocolos para os dois modelos de dor em ratinho, assim como o desenvolvimento de condições no biotério necessárias à realização dos testes comportamentais para avaliar a ansiedade e/ou a depressão nesses animais.
- Contributos para o desenvolvimento de fagoterapias para infecções hospitalares por Pseudomonas aeruginosa multirresistentesPublication . Reis, Ana Cristina Pereira Alves dos; Fernandes, Rúben; Machado, Pilar Baylina; Ferraz, RicardoAs infecções hospitalares podem ser evitadas pelo controlo de determinados factores inerentes aos profissionais, material, ambiente. Neste momento, existe legislação própria de forma a regulamentar procedimentos que evitam a propagação da infecção e/ou dos agentes que a causam. A Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa oportunista responsável por grande parte das infecções hospitalares. Pelo facto de ser oportunista é mais frequente em pacientes imunocomprometidos, sujeitos a transplantes, intervenções cirúrgicas, entre outros. Em suma, esta tese contribui para a compreensão da biologia da P. aeruginosa, tratamento antibacteriano e sua resistência, bem como compreender a influência do estado metabólico dos indivíduos na infecção. Este estudo teve como objectivo compreender os factores de resistência manifestados pela P.aeruginosa no sentido de desenvolver alternativas terapêuticas para este agente. Numa primeira fase foram caracterizados 72 isolados hospitalares de P. aeruginosa e 91,67% manifestou resistência a mais do que 3 classes de Antimicrobianos.
- Estudo da evolução do estado clínico de mulheres com amostras de citologia ginecológica negativa e teste para HPV de alto risco positivoPublication . Alves, Daniela Sofia CarvalhoEm Portugal, o segundo cancro mais frequente nas mulheres é o cancro do colo do útero, representando cerca de 6% de todos os cancros nas mulheres. O vírus papiloma humano, Human papillomavirus (HPV) que está presente em cerca de 90% das lesões de alto grau e cancro cervical, sendo dividido em dois grupos: o HPV de alto risco que está associado a lesões de alto grau e cancro do colo do útero e o HPV de baixo risco que raramente causa lesão. Neste trabalho visamos estabelecer se houve evolução para lesão nos casos de pacientes com citologia normal e tipagem para HPV de alto risco positiva. Estudaram-se 51 pacientes do Hospital Pedro Hispano, dividido em dois grandes grupos, um com mulheres até aos 35 anos, outro com mulheres com mais de 35 anos, com resultado da citologia ginecológica normal, e uma tipagem para HPV de alto risco positiva. Das 51 mulheres, 72,6% fizeram segunda colheita e destas 54.9% não fizeram tipagem de HPV de alto risco. Para avaliação dos resultados foram usados os testes de estatística descritiva, nomeadamente os de frequência. Das 23 segundas colheitas foi extraído ADN e foi analisado num equipamento específico para detectar a presença de HPV de alto risco. Das amostras testadas verificou-se que 37,8 % das mulheres continuaram positivas para HPV de alto risco e destas 8,7% evoluiu para uma lesão de alto grau. Apesar de haver uma percentagem razoável de evolução para lesão nestes casos, o número da amostra é reduzido, pelo que condiciona a extrapolação para a população. Além disso o tempo de follow-up é relativamente curto, e seria interessante seguir estas mulheres por um período mais longo para confirmar esta tendência. Fazer a quantificação dos oncogenes E6/E7, traria talvez resultados mais consistentes uma vez que se poderia verificar se o ADN do vírus já se encontrava integrado no genoma da mulher.
- Isolamento e cultura de células do tecido cavernoso humano: carcterizaçã fenotípica e identificação de purinoceptores por imunoflurescênciaPublication . Leite, Carla Alexandra Araújo; Correia-de-Sá, PauloA adenosina é um nucleosídeo ubíquo responsável pela regulação da actividade celular através da activação de receptores existentes na membrana das células. A activação de alguns destes receptores intervém na regulação do tónus vascular do tecido cavernoso animal e humano. Estudos anteriores mostraram que os receptores da adenosina dos subtipos A2A e A2B, supostamente localizados no músculo liso e no endotélio vascular do tecido cavernoso humano, respectivamente, estão alterados do ponto de vista funcional em casos de disfunção eréctil vasculogénica (DEV). A DEV está associada a factores de risco, como a Diabetes mellitus do tipo 2, a hipertensão arterial, a hipercolesterolemia e hábitos tabágicos; estes factores estão também associados a alterações marcadas da função endotelial e, consequentemente, a um risco aumentado de doenças cardiovasculares. Sendo a adenosina um potente regulador do tónus vascular, admite-se que a sua participação seja fundamental na regulação da erecção peniana. É, assim, possível supor que a perda do efeito tónico de relaxamento nos vasos penianos da adenosina possa estar na origem da DEV. Para melhor caracterizar o papel da adenosina no controlo da erecção peniana, este estudo procurou estabelecer um protocolo apropriado para o isolamento de células musculares lisas e endoteliais a partir de amostras de tecido cavernoso humano e de rato usando a técnica de explante e a de dissociação enzimática. A caracterização fenotípica das células foi realizada por imunofluorescência indirecta. Esta técnica também foi usada para identificar a presença de receptores purinérgicos nas células isoladas em cultura. Comparativamente com a técnica de explante, a dissociação enzimática das células revelou-se mais eficaz para o isolamento e cultura das células do tecido cavernoso. Esta técnica apresentou um maior rendimento celular, gerando culturas com um elevado número de células viáveis e com um fenótipo bem definido num menor intervalo de tempo. Neste estudo confirmou-se a suspeita fundamentada por ensaios funcionais de que as células musculares lisas do tecido cavernoso humano expressam receptores da adenosina do subtipo A2A. Esta marcação co-localiza com o marcador fenotípico de fibras musculares lisas, α-actina muscular lisa, exibindo um padrão de fluorescência característico. Os resultados preliminares obtidos neste estudo permitem encarar com optimismo ensaios futuros destinados à caracterização de receptores e de enzimas envolvidas na sinalização purinérgica no tecido cavernoso humano e, até, iniciar estudos funcionais em célula única (e.g. “single-cell calcium imaging”) para avaliar possíveis alterações funcionais com significado terapêutico em doentes portadores de DEV resistente a fármacos.
- Molecular and biochemical mechanisms involved in the toxicity of a marine cyanobacteria compound on cancer cell linesPublication . Melissa Sofia Figueiredo CoutoIn recent years marine biotechnology has revealed a crucial role in the future of bioindustry. Among the many marine resources, cyanobacteria have shown great potential in the production of bioactive compounds with diverse applicability. The pharmacological potential of these organisms has been one of the most explored areas in particular its antibacterial, antifungal and anticancer potential. This work was based on the assessment of potential anticancer compound E13010 F 5.4 isolated from marine cyanobacteria strain Synechocystis salina LEGE 06099. Thus the aim of this work was to explore molecular and biochemical mechanisms underlying the bioactivity detected in human cancer cells, specifically in lines RKO colon carcinoma and HT-29. The isolation of the compound was performed from biomass obtained by large-scale culture. To obtain the compound fractionation was carried and confirmation and isolation performed by Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Thin Layer Chromatography (TLC) and High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). Cell viability assays were performed based on reduction of 3- (4,5-dimetiltiaziol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) to assess the cytotoxic potential of the compound. From the battery of cell lines RKO (colon carcinoma), HT-29 (colorectal adenocarcinoma), MG-63 (osteosarcoma) and T47D (breast carcinoma) the cell lines RKO and HT-29 were selected for elucidation of mechanisms of cytotoxicity. For the elucidation of the mechanisms involved in cytotoxicity the cell lines RKO and HT29 were exposed to the compound. A genomic approach based in the mRNA expression of genes involved in apoptosis and cell cycle by Real-Time PCR and a proteomic approach based on the separation of proteins by two-dimensional electrophoresis (2DGE) was performed. For mRNA expression were selected the genes RPL8, HPRT1, VDAC, SHMT2, CCNE, CCNB1, P21CIP, BCL-2 and BAD and for proteomics isoelectric focussing between 3 – 10 and molecular weight of 19 – 117 kDa separated by polyacrylamide gels (2DGE). The MTT results confirmed the reduction of the cell viability. The RT-PCR results for the expression of genes studied were not yet fully elucidative. For the cell line RKO there was a significant reduction in the expression of the gene P21CIP, and a tendency for reduction in the BAD gene expression and for increased expression of gene CCNB1, pointing to an effort for cell proliferation. In HT-29 cell line, there was a tendency for increase in the expression of P21CIP and BAD, which may explain the reduction in cell viability. The 2DGE results indicate proteomic patterns with differentially altered spots in the treated and control cells with both qualitative and quantitative differences, and differences in response between the RKO and HT-29 cell lines.
- Nanopartículas hibrídas para sistemas de drug delivery inteligentesPublication . Carla Sofia Martins CabralA nanotecnologia é uma ciência multidisciplinar que consiste na otimização das propriedades da matéria permitindo assim o desenvolvimento de sistemas com um tamanho manométrico. A aplicação da nanotecnologia na medicina surge como um campo de pesquisa que esta a gerar um grande interesse, principalmente em sistemas de libertação controlada de fármacos. A nanotecnologia, e a sua aplicação na área da nanomedicina, em particular em drug delivery systems, tem sido alvo de um desenvolvimento acentuado. A administração de fármacos ocorre sobretudo por via oral ou por injeção direta no organismo. O percurso destes fármacos desde do local de entrada no organismo até ao tecido-alvo obriga que estes entrem em contato com os outros tecidos podendo interagir com eles. Deste modo, esta interação química pode produzir efeitos indesejáveis no organismo e reduzir a capacidade de ação do fármaco. Tem-se verificado, nas últimas décadas, um grande desenvolvimento de sistemas que contornam estes problemas, tais como a quantidade e o período de administração do fármaco bem como o seu local de libertação e atuação específicos. Este estudo surge com esta necessidade de se desenvolver sistemas de libertação controlada de fármacos. O objetivo destes sistemas inteligentes é controlar a libertação de fármacos por um dado período de tempo, a dose, a diminuição da toxidade, o aumento da permanência em circulação e o aumento da eficácia terapêutica através da libertação progressiva e controlada do fármaco por administrações menos frequentes. Além de todas estas vantagens, a administração destes sistemas possibilita a libertação dos fármacos em locais específicos, tais como em tumores e, assim, minimizar os efeitos colaterais indesejados dos fármacos em outros tecidos. O presente trabalho visa o desenvolvimento de novos biomateriais utilizando nanopartículas mesoporosas de sílica (MSN) e nanopartículas (NPs) metálicas de ouro para a aplicação a sistemas de libertação controlada de fármacos. Para isto, estudou-se a libertação de doxorrubicina (DOX) encapsulada em NPs e nanocápsulas mesoporosas de sílica tanto em solução como em superfícies como em vidro. Os resultados obtidos mostraram que as NPs apresentam uma grande capacidade de encapsulação com 36 ng DOX/mg partícula. O tempo de libertação em superfície (vidro) foi estimado em 50 horas enquanto que em solução obteve-se um período inferior a 10 horas. Em relação as NPs de ouro pode-se observar como estas promovem a libertação do fármaco ao serem irradiadas mediante um laser. Deste modo, estas NPs podem ser úteis para sistemas de libertação controlada de fármacos e para várias aplicações na nanomedicina.
- Oxidative Stress in Diabetic NeuropathyPublication . Sofia Alexandrina Queirós da CunhaFor treating chronic pain, a multifactorial condition, is needed a suitable diagnosis which allows the differentiation in its many components. Diabetic neuropathy is a worldwide disease with great impact in the modern society. Diabetes may leads to the production of reactive oxygen species that are associated to oxidative stress, which may be a key factor in the development of diabetic neuropathy. The main goal is to inquire a potential association between chronic pain, diabetic neuropathy and oxidative stress. Thus, was performed a meta-analysis that permitted the causal evaluation between oxidative stress and diabetic neuropathy, and, a pain evaluation was accomplished in a convenience sample using validated surveys – Brief Pain Inventory (BPI) and Douleur Neuropathique 4 (DN4). Through the meta-analysis it was possible evaluate oxidative stress biomarkers, such lipid peroxidation, superoxide dismutase and catalase activities, and reduced glutathione. 9 studies were selected and all were performed in mouse models. The levels of lipid peroxidation were increased in all the studies, however the levels of the other biomarkers were diminished in diabetic models comparatively to healthy controls. In the evaluation of convenience sample, 84 surveys were collected along the four seasons: summer, autumn, winter and spring. The pain complaints were described in terms of local, intensity, impact, relief by medication and its effect on daily activities using BPI questionnaire. The scores obtained in BPI indicate the presence of moderate to severe pain, with increased complaints in autumn and spring, and implications in daily activities, transversal to all groups. To determine the main features associated with neuropathic pain it was used DN4 questionnaire. The DN4 indicated the presence of nearly 50% of patients with neuropathic pain. The results suggest that being female, the increased age and being retired can influence chronic pain and neuropathic pain in patients. As main conclusions, it was possible to verify an association between oxidative stress, and neuropathic pain, and, also, that weather conditions may influence the pain complaints and its prevalence.