ESS - CQB - Posters apresentados em eventos científicos
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- Development of a stable melanoma dual reporter cell line expressing Luciferase and GFPPublication . Aguiar, Gonçalo; Torres, Sílvia; Prudêncio, Cristina; Soares, Raquel; Coelho, Pedro; Prudêncio, Cristina; Coelho, PedroMelanoma is the most aggressive and lethal form of skin cancer, with a high risk of metastatic spread. Obesity is recognized as a risk factor for various types of cancer. However, regarding melanoma, this association remains controversial. Obesity might act as a double-edged sword in melanoma, promoting primary tumour growth but at the same time limiting metastatic spread - the "obesity paradox”. Herein, we aimed to create a stable murine B16F10 melanoma cell line expressing both firefly luciferase (Luc) and green fluorescent protein (GFP), which will later be engrafted into diet induced-obesity animal model for future in vivo studies. B16F10-Luc-GFP cells were generated by transfection with premade lentiviral particles, featuring a construct with Luc and GFP under a cytomegalovirus promoter and mediated by a F2A element. The antibiotic selection marker (puromycin) is expressed under a Rous sarcoma virus promoter. Afterwards, the transfected cells were selected with 1 μg/ml of puromycin. The clones with the highest levels of GFP-positive cells and GFP fluorescence were purified by two rounds of cell sorting and submitted to fluorescence and bioluminescence quantification, morphology, injury, BrdU incorporation, 7-AAD, and PI cell cycle assays and compared to the parental cell line. B16F10-Luc-GFP were successfully generated, and both GFP fluorescence and D-luciferin bioluminescence are present and proportional to cell density. As expected, the parental cell line didn’t display GFP or Luc activities. Moreover, transduced cells exhibit similar morphology, motility, proliferation, viability, and cell cycle progression as B16F10 cells. Conclusions: Altogether, the future engraftment of B16F10-LucGFP in obese mice, will improve melanoma research models, enabling the in vivo and ex vivo visualization of primary tumours and metastasis, providing a better understanding of the underlying molecular mechanisms, to clarify the “obesity paradox” in melanoma.
- Exploring actinobacterial diversity in Ruta graveolens: Phylogenetic identification and bioactive potential investigationPublication . Ferreira, Sílvia; Ribeiro, Inês; Oliveira, Rui S.; Carvalho, M. FátimaMedicinal plants and their components have been utilized in traditional medicine for centuries and have significantly influenced the development of modern medicine. Ruta graveolens, a Rutaceae medical plant, is known for its antibacterial, anti-inflammatory and cytotoxic properties. Actinobacteria are a rich source of compounds exhibiting diverse biological activities and potential therapeutic applications. The aim of this study was to perform the phylogenetic identification of a collection of actinobacterial strains previously isolated from R. graveolens and to investigate their bioactive potential. Actinobacterial strains previously isolated from stem, roots and leaves of R. graveolens were grown in Actinomycete Isolation Agar (AIA) or Starch-Casein-Nitrate-Agar (SCN). DNA from grown cultures was extracted and phylogenetically identified through 16S rRNA gene sequencing. For each strain, organic extracts were performed and used for the screening of antimicrobial activity, using the disk diffusion test, against four reference bacteria (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, Escherichia coli) and one yeast (Candida albicans). Thirty-two actinobacterial isolates were so far identified. Most of the strains was identified as Tsukamurella tyrosinosolvens, constituting 13 out of 32 isolates, followed by 8 Streptomyces sp., 7 Brevibacterium sediminis, 3 Microbacterium ginsengiterrae, and one Gordonia hydrophobica. The organic extracts obtained from each isolate were tested for their antimicrobial activity. Up to moment, no significant bioactivity was detected in the reference strains screened in this study. A collection of 32 actinobacterial strains was obtained from various parts of the medicinal plant R. graveolens. Though no relevant antimicrobial activity was yet found, extracts of these actinobacteria open new opportunities to explore their bioactive potentials with therapeutic applications.
- Synthesis od new surface-active ionic liquids derived from antimalarial drugs and bile acidsPublication . Silva, Ana Teresa; Oliveira, Isabel; Duarte, Denise; Moita, Diana; Prudêncio, Miguel; Nogueira, Fátima; Teixeira, Cátia; Ferraz, Ricardo; Marques, Eduardo F.; Gomes, PaulaMalaria is a parasitic disease that occurs mostly in low-income countries, thus its containment or, ultimately, eradication demands new methodologies and synthetic strategies that are simple and inexpensive. Ionic liquids (ILs) may assume a prominent role in this scenario, as they are catching the attention of the Medicinal Chemistry community owing to their intrinsic biological activity and affordable synthesis through straightforward methods. In this context, our focus consists of using an acid-base reaction between basic antimalarial aminoquinolines, such as chloroquine and primaquine, and natural amphiphilic acids, such as fatty and bile acids. The resulting ILs are expected to preserve the parent aminoquinolines' antimalarial action, while retaining the surface activity of the parent amphiphilic acids, thus facilitating the permeation of the whole IL structure through important biological barriers. In other words, our aim is to develop surface-active ionic liquids (SAILs) with intrinsic antimalarial properties. Results obtained thus far will be presented, demonstrating that SAILs can be produced which are active against different stages of malaria parasite development in the human host. Self-aggregation properties of these SAILs are currently under investigation and will be timely reported.
- New 4-aminoacridine-cinnamic acid conjugates as multi-stage antimalarial hitsPublication . Fonte, Mélanie; Fontinha, Diana; Moita, Diana; Prades, Omar; Padilla, Yunuen; Ferraz, Ricardo; Fernàndez-Busquets, Xavier; Prudêncio, Miguel; Gomes, Paula; Teixeira, CátiaThe eradication of malaria remains to be achieved, mainly due to the continued spread of drugresistant parasites. To overcome this, multi-stage drugs have been prioritized in antimalarial drug discovery, since targeting more than one process in the Plasmodium’s life cycle may increase efficiency, while decreasing the chances of resistance emergence by the parasite. Quinacrine (QN) was the first synthetic antiplasmodial drug active against blood forms of the Plasmodium parasite but was rapidly superseded by chloroquine (CQ) which has greater safety, efficiency, and bioavailability. Analysing the QN structure, its acridine core is a fusion between the heterocycle core of CQ and primaquine (PQ), another antiplasmodial drug active against liver forms of the parasite, and able to block malaria transmission. A new family of QN derivatives reported by us, 4-aminoacridines, corresponding to the merge of CQ core and PQ, showed moderate dual-stage antimalarial activity. We have now developed a second generation of 4-aminoacridines (Fig.1) through their conjugation to cinnamic acids (CA) of natural origin that have been reported to enhance antimalarial activity when conjugated to antimalarials. In this communication, we will present the chemical synthesis of this new family of N-cinnamoyl-4-aminoacridines and the in vitro assessment or their activity against a) liver stages of P. berghei, b) erythrocytic forms of P. falciparum, and c) early and mature gametocytes of P. falciparum. Results demonstrate that the conjugation of the CA moiety to the 4-aminoacridine core delivers new compounds with enhanced in vitro activity against all three stages of the malaria parasite lifecycle inside mammalian hosts.
- Qualidade nutricional do pão: adequação à população com insuficiência renal crónicaPublication . Costa, Anabela S.G.; Pinto, Isabel; Santo, Liliana Espírito; Oliveira, M. Beatriz P. P.O pão continua a ser um dos alimentos mais consumidos pelo Homem, integrando a base da dieta mediterrânica. O seu consumo é uma questão cultural na sociedade portuguesa, sendo fundamental o controlo dos seus teores de sal. Como é sabido, a ingestão de sal pode contribuir para o desenvolvimento de doenças, tais como a hipertensão arterial (HTA) e doenças cardiovasculares. Com o objetivo de reduzir o sal ingerido com o consumo de pão, a lei n.º 75/2009, de 12 de agosto, limitou o teor máximo a 1,4 g de cloreto de sódio por 100 g de pão, o que corresponde a 0,55 g de sódio. Neste trabalho comparou-se a composição nutricional (proteína, gordura, hidratos de carbono e cinzas) e ainda o valor calórico de onze tipos de pão (tigre, vianinha, sem sal, de beterraba, trigo e centeio, rústico, bola rústica, bola mistura, regueifa, escuro e bijou), à base de farinha de trigo. As amostras foram adquiridas em duas grandes superfícies comerciais, com fabrico próprio, do distrito do Porto. Para avaliar a influência de algum ingrediente nos teores de sal analisou-se a lista de ingredientes descrita no rótulo de cada amostra. O objetivo final deste trabalho foi selecionar um tipo de pão mais direcionado para a população com Insuficiência Renal Crónica. O perfil nutricional foi avaliado utilizando metodologias oficiais de análise de alimentos (AOAC) [1]. O teor em cloretos determinou-se, a partir da amostra incinerada, pelo Método de Mohr, segundo as normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz [2]. Perante os resultados obtidos, é difícil encontrar um pão que seja o ideal, pois os que apresentam um baixo teor em proteína, como a vianinha, contêm também um elevado teor de gordura e sal. Por sua vez, o pão escuro, que tem um baixo teor de sal e gordura, é o que apresenta um teor de proteína mais elevado. A doença renal exige um plano alimentar individualizado. O desafio deste trabalho foi encontrar o melhor tipo de pão que se adequasse a tal doença/disfunção, sabendo que o pão é um alimento largamente consumido, até por questões culturais. O ideal será um pão com baixo teor de proteína e sal e elevado teor em fibras (solúvel e insolúvel). O pão sem sal parece ser, dentro dos pães analisados, o mais equilibrado para esta situação em particular.
- Evaluation of RRAS2 and TTP1 promoter mutations in thyroid tumoursPublication . Leite, Rúben; Dias, Carolina; Soares, Paula; Vinagre, JoãoThyroid cancer is the most frequent endocrine neoplasm, being the tenth most prevalent in both genders and it presenting an overall good prognosis [1]. Ras related 2 (R-Ras2), also known as TC21, is a GTP-binding protein that together with R-Ras1 and R-Ras3, is part of the R-Ras GTPase subfamily. Mutations in RRAS2 gene in the long-tailed hotspot Q72L/H block the hydrolysis of guanosine triphosphate (GTP) in Ras superfamily proteins, generating constitutively active proteins that will preferentially bound to GTP [2]. This gene is composed by five exons encoding a member of the Ras superfamily that participates in the RAS-MAPK pathway [3]. The tripeptidyl peptidase 1 promoter (TPP1p) encodes the telomere-binding protein TPP1 that recruits telomerase to the telomeres. This process plays a key role in the telomere stability and length regulation. Mutations in this promoter were reported to create novel transcription factor binding sites as previously presented for telomerase promoter (TERTp) [4]. Co-expression of these two promoters lead to telomere elongation, indicating that mutations in the TPP1 and TERT promoter cooperate for the immortalisation of cancer cells [5]. Our project aimed to evaluate mutations in the Q72L hotspot of the RRAS2 gene and in the TPP1p in thyroid tumours. Upon genotyping of RRas2 and TPP1p, we conclude that the presence of mutations in the Q72L hotspot may not represent an oncogenic event, as we did not detect them. For TPP1p, still under study, although already presented in the literature, at the moment we have not detected them in our series, pointing that they may be a rare event in thyroid tumours.
- Targeting mitochondrial TERT to overcome therapeutic resistancePublication . Chantre, Ana; Correia, Marcelo; Soares, Paula; Máximo, Valdemar; Lima, Raquel T.Reactivation of telomerase is a common process in most human tumours [1, 2], usually due to reexpression of its catalytic subunit, the telomerase reverse transcriptase (TERT), contributing to cell immortalization [3]. In thyroid cancer (TC), it was demonstrated that TERT reactivation is often associated with distant metastases, therapy resistance and shorter survival rates of patients [4], however TERTs’ canonical functions are not enough to explain these clinical associations. Some works have been proposing a possible non-canonical function of TERT, specifically in mitochondria, as it can translocate into this organelle due to the presence of a N-terminal target mitochondrial sequence (MTS) [1]. In mitochondria, TERT seems to contribute to: protection of mtDNA under oxidative stress; decrease in the production of ROS and apoptosis; increase in mitochondrial membrane potential; and improvement of cellular respiration [5]. Our hypothesis is that the translocation of TERT into mitochondria, in TC cells, may indicate a mechanism of response to oxidative stress caused by cancer therapeutics. Therefore, in this project we are evaluating TERTs’ impact in mitochondria in a CRISPR-Cas9 altered TC cell line which lacks the MTS region of TERT (preventing its translocation into this organelle) in comparison with control cells. Currently, we are characterizing the altered cells regarding cell growth and viability (Trypan Blue Exclusion and PrestoBlue Assays), cell cycle profile and proliferation (Flow Cytometry with PI, BrdU Incorporation Asssay). We will further evaluate the effects of these alterations in mitochondrial functions, namely oxidative stress (specific dyes), apoptosis (Flow Cytometry with Annexin V/PI), and metabolism (Seahorse Analyser) as well as in the cellular response to therapeutic drugs. Overall, this study will allow to evaluate the relevance of mitochondrial TERT-related functions as they might contribute to the discovery of novel targets and therapeutic opportunities for TC patients.
- Stress oxidativo em diabéticos com fígado gordo não-alcoólicoPublication . Martins, B.; Rigor, J.; Rocha, A. C.; Dias, M. C.; Luís, Carla; Baylina, Pilar; Mendes--Martins, D.; Fernandes, RúbenO fígado gordo não-alcoólico (FGNA) é caracterizado pela acumulação excessiva de gordura, especialmente triglicerídeos, nos hepatócitos. Estima-se que a prevalência de FGNA em todo o mundo seja aproximadamente 25%. A prevalência de FGNA em indivíduos com diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) é consideravelmente superior em relação aos indivíduos com diabetes mellitus tipo 1, sendo aproximadamente 70%. No entanto, há relatos da existência de uma ampla variação (21% - 87%) que depende de distintos fatores. O aumento de glicose intra-hepática e de piruvato aumentam o fluxo metabólico oxidativo, bem como a biogénese de gordura intra-hepática. Esta acumulação de gordura resulta em stress oxidativo e consequente indução de inflamação crónica e necrose. Compreender o envolvimento da superóxido dismutase 1 e da catalase no estado oxidativo total em diabéticos com FGNA. Os níveis de stress oxidativo são significativamente superiores em diabéticos com FGNA em relação aos indivíduos saudáveis. Como o FGNA representa um problema crescente, principalmente nas sociedades ocidentais, é prioritário encontrar um método acessível e reprodutível para diagnosticar precocemente o FGNA, melhorando a gestão clínica do doente. Caso esta patologia não seja tratada adequadamente, pode progredir para esteatohepatite não alcoólica, cirrose ou hepatocarcinoma.
- Estado oxidativo em doentes de COVID-19 diabéticosPublication . Rocha, A. C.; Martins, B.; Dias, M. C.; Rigor, J.; Baylina, Pilar; Monteiro-Soares, M.; Mendes-Martins, D.; Fernandes, RúbenO novo coronavírus, síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2 (SARS-CoV-2) é responsável pela mais recente doença infeciosa (Covid-19). Até à data, esta doença já infetou mais de 100 milhões de pessoas, tendo provocado mais de 2 milhões de mortes em todo o mundo. A diabetes tem sido identificada como um fator de risco importante para a progressão da síndrome respiratória aguda grave e mortalidade em doentes infetados com SARS-CoV-2, apresentando uma prevalência superior a 30% nesses doentes, em países europeus. Sabe-se que os processos envolvidos nas infeções virais respiratórias, incluindo a Covid-19, resultam no desenvolvimento de stress oxidativo, sendo um contributo importante para a sua patogénese. Adicionalmente, os vários fatores de risco associados à Covid-19, nomeadamente idade avançada, hiperglicemia, e obesidade, estão associados ao aumento do stress oxidativo. Desta forma, podemos supor que o aumento do stress oxidativo está associado a maior gravidade da doença, nomeadamente em doentes diabéticos. Avaliar o envolvimento da superóxido dismutase 1 e da catalase no estado oxidativo total em pacientes diabéticos infetados com Covid-19. Foi efetuado um estudo analítico caso-controlo, tendo sido realizadas três metodologias para avaliar a atividade da superóxido dismutase 1, atividade da catalase e estado oxidativo total. Os níveis de stress oxidativo foram significativamente superiores nos pacientes diabéticos infetados com Covid-19, comparativamente com controlos saudáveis. Dados epidemiológicos mostram que existe uma prevalência superior de Covid-19 em pacientes diabéticos. Por outro lado, estudos demonstram que a diabetes está associada a maior risco para desenvolver formas mais graves e fatais de Covid-19. Atualmente, estão a ser realizados ensaios para testar antioxidantes como agente terapêutico nestes pacientes. A compreensão do estado oxidativo total nestes pacientes permite compreender melhor a associação entre estas duas patologias, resultando numa melhor prestação de cuidados de saúde a estes doentes.
- Stress oxidativo em doentes com neuropatia diabéticaPublication . Dias, M. C.; Rocha, A. C.; Martins, B.; Rigor, J.; Luís, C.; Baylina, Pilar; Mendes, D.; Fernandes, RúbenA diabetes está associada a diversas morbilidades como a Neuropatia Diabética. Esta patologia é descrita como uma lesão nos nervos que ocorre devido à exposição prolongada à hiperglicemia. A neuropatia afeta indivíduos com diabetes tipo 1, mas principalmente os que têm diabetes tipo 2. Em caso de hiperglicemia, o excesso de glicose afeta diversas vias metabólicas provocando a acumulação de metabolitos tóxicos e, consequentemente, a formação excessiva de espécies reativas de oxigénio (ROS). O aumento do stress oxidativo e diminuição da atividade das enzimas antioxidantes pode ser um fator influenciador no aparecimento da neuropatia diabética, uma vez que pode afetar várias células do sistema nervoso periférico, provocando a perda de células de Schwann e mielina nos axónios. Este trabalho tem como objetivo o estudo do stress oxidativo envolvido na neuropatia diabética avaliando o estado oxidativo total, bem como a atividade de enzimas antioxidantes como a catálase e o superóxido dismutase I. Ao longo do projeto foi possível verificar um aumento do stress oxidativo nos indivíduos diabéticos com neuropatias associadas (x=30) comparando com os indivíduos controlo (x=30). O stress oxidativo influencia a formação de neuropatias em diabéticos e, desta forma, seria importante verificar a possibilidade de utilizar biomarcadores e tratamentos dirigidos para as espécies reativas de oxigénio como forma de prevenção e tratamento dos pacientes.