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Publicação
Non-invasive screening strategies for colorectal cancer: Protocol optimization and RNA biomarker identification
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Resumo(s)
Colorectal cancer (CRC) continues to have high incidence and mortality and benefits from non-invasive screening strategies that detect precursor lesions early and increase adherence. Circulating biomarkers and fecal transcriptomic profiles are promising approaches, but they require clinical validation and robust laboratory protocols. (i) Evaluate selected plasma microRNAs as potential biomarkers for detecting lesions across the neoplastic development of CRC; (ii) optimize a workflow for detecting human fecal RNA, comparing critical processing steps and cDNA synthesis conditions to improve performance and reproducibility in RT-qPCR. Case-control study with four clinical groups (no lesion, low-grade dysplasia, high-grade dysplasia/advanced lesions, and CRC). Four plasma microRNAs were quantified by RT-qPCR. In parallel, different conditions in the fecal RNA extraction process and the influence of different reverse transcriptases and primer types were tested to optimize the detection of human mRNA. Plasma microRNAs showed consistent expression disturbances across groups, with better performance when combined in panels, suggesting discriminatory value. In fecal RNA, debris removal and optimized centrifugation parameters increased extraction yield and enhanced the capacity to detect human mRNA. Kit- and primer-dependent differences were observed in cDNA synthesis, with appropriate selection of these elements improving the efficiency and reproducibility of RT-qPCR. The results support the potential of plasma microRNA panels as a complement to current screening methods and establish an optimized protocol for fecal RNA, creating a technical foundation for multicenter validation and multi-matrix integration in CRC screening.
O cancro colorretal (CCR) continua a ter elevada incidência e mortalidade, beneficiando de estratégias de rastreio não invasivas que detetem precocemente lesões precursoras e aumentem a adesão ao rastreio. A deteção de biomarcadores a nível sanguíneo e o estudo de perfis transcriptómicos fecais são abordagens promissoras, mas exigem validação clínica e protocolos laboratoriais robustos. (i) Avaliar o potencial de microRNAs plasmáticos na deteção de lesões colorretais prémalignas e malignas; (ii) otimizar um fluxo de trabalho para deteção a nível fecal de mRNA humano. A expressão em amostras sanguíneas dos 4 microRNAs selecionados na literatura foi quantificada por RT-qPCR em 252 amostras de indivíduos submetidos a colonoscopia e com lesões de diferentes fenótipos. Em paralelo, em amostras fecais otimizou-se o processo de extração de RNA e a conversão de mRNA humano em cDNA. Os 4 microRNAs analisados demonstraram diferenças de expressão nos grupos de indivíduos com lesões com displasia de alto grau e cancro colorretal, bem como no grupo de lesões com elevado risco para o desenvolvimento de CRC. Contudo, os 4 microRNAs avaliados de forma isolada demonstraram uma baixa capacidade discriminatória. No entanto, a combinação destes microRNAs com a idade e o género demonstrou uma boa performance para a deteção de pólipos e cancro colorretal (AUC: 0.761; Sensibilidade 62%; Especificidade: 78%). Relativamente à otimização do processo de extração e de deteção de mRNA humano a nível fecal, a remoção de detritos e o estabelecimento de parâmetros de centrifugação otimizados aumentaram o rendimento da extração e aumentaram a capacidade de deteção de mRNA humano. Observaram-se diferenças dependentes do kit e do primer usados na síntese de cDNA, tendo a seleção adequada destes elementos, melhorado a eficiência e a reprodutibilidade do RT-qPCR. Os resultados apoiam o uso potencial dos microRNAs circulantes como complemento a métodos atuais de rastreio e estabelecem um protocolo otimizado para extração e conversão de RNA fecal, criando uma base técnica para validação multicêntrica e integração multimatriz no rastreio do CCR.
O cancro colorretal (CCR) continua a ter elevada incidência e mortalidade, beneficiando de estratégias de rastreio não invasivas que detetem precocemente lesões precursoras e aumentem a adesão ao rastreio. A deteção de biomarcadores a nível sanguíneo e o estudo de perfis transcriptómicos fecais são abordagens promissoras, mas exigem validação clínica e protocolos laboratoriais robustos. (i) Avaliar o potencial de microRNAs plasmáticos na deteção de lesões colorretais prémalignas e malignas; (ii) otimizar um fluxo de trabalho para deteção a nível fecal de mRNA humano. A expressão em amostras sanguíneas dos 4 microRNAs selecionados na literatura foi quantificada por RT-qPCR em 252 amostras de indivíduos submetidos a colonoscopia e com lesões de diferentes fenótipos. Em paralelo, em amostras fecais otimizou-se o processo de extração de RNA e a conversão de mRNA humano em cDNA. Os 4 microRNAs analisados demonstraram diferenças de expressão nos grupos de indivíduos com lesões com displasia de alto grau e cancro colorretal, bem como no grupo de lesões com elevado risco para o desenvolvimento de CRC. Contudo, os 4 microRNAs avaliados de forma isolada demonstraram uma baixa capacidade discriminatória. No entanto, a combinação destes microRNAs com a idade e o género demonstrou uma boa performance para a deteção de pólipos e cancro colorretal (AUC: 0.761; Sensibilidade 62%; Especificidade: 78%). Relativamente à otimização do processo de extração e de deteção de mRNA humano a nível fecal, a remoção de detritos e o estabelecimento de parâmetros de centrifugação otimizados aumentaram o rendimento da extração e aumentaram a capacidade de deteção de mRNA humano. Observaram-se diferenças dependentes do kit e do primer usados na síntese de cDNA, tendo a seleção adequada destes elementos, melhorado a eficiência e a reprodutibilidade do RT-qPCR. Os resultados apoiam o uso potencial dos microRNAs circulantes como complemento a métodos atuais de rastreio e estabelecem um protocolo otimizado para extração e conversão de RNA fecal, criando uma base técnica para validação multicêntrica e integração multimatriz no rastreio do CCR.
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Palavras-chave
Colorectal cancer Screening Biomarker microRNA Fecal RNA