Publication
Bioprinting strategies to engineer biomimetic 3D models of skin burn wounds
| dc.contributor.advisor | Ribeiro, Maria Cristina Castro | |
| dc.contributor.author | Bebiano, Luís Miguel Brunhoso | |
| dc.date.accessioned | 2023-02-08T11:28:38Z | |
| dc.date.embargo | 2025-11-08 | |
| dc.date.issued | 2022 | |
| dc.description.abstract | As queimaduras da pele são consideradas um grave problema de saúde pública em todo o mundo, sendo uma das principais causas de morbidade, dor e, em alguns casos, desfiguração do paciente. Apesar de existirem terapias comercialmente disponíveis, como os curativos modernos e os substitutos da pele, ainda existem limitações críticas no que respeita ao desenvolvimento de terapias mais eficazes que possam diminuir a ocorrência de fibrose e melhorar os resultados estéticos e funcionais. Para tal, torna-se crucial melhorar a nossa compreensão sobre as respostas e mecanismos a nível celular e da matriz extracelular (MEC) que ocorrem após a lesão. Com o objetivo de endereçar as limitações mencionadas, uma nova bioink constituída por um único polímero foi desenvolvida para criar modelos 3D in vitro relevantes a nível patofisiológico de queimaduras da pele. Inicialmente, uma bioink derivada de pectina e funcionalizada com grupos funcionais maleimida foi desenvolvida usando uma estratégia de reticulação dupla através de gelificação iónica e da reação de adição de Michael. Esta estratégia permitiu não só modular as propriedades mecânicas (2593.00 ± 261.50 até 5860.00 ± 386.10 Pa) dos hidrogéis na gama de valores da pela nativa, mas também recriar importantes propriedades da MEC da pele a nível bioquímico e biofísico. Um estudo sistemático foi realizado para avaliar a influência de agentes reticulantes degradáveis ou não degradáveis através das metaloproteinases da matriz nas propriedades do hidrogel e na resposta celular. Curiosamente, todas as formulações permitiram a formação de hidrogéis com uma distribuição uniforme de fibroblastos da derme em 3D, embora os resultados sugiram que os hidrogéis degradáveis permitem uma maior formação de redes celulares interconectadas. Além disso, os hidrogéis degradáveis também aumentaram a deposição de componentes da MEC em comparação com os hidrogéis não degradáveis. Para criar um modelo in vitro 3D de pele em bicamada, os queratinócitos foram cultivados na parte superior de hidrogéis contendo fibroblastos (derme), e mantidos em cultura por 28 dias. Após este período de tempo, um modelo de pele in vitro estruturalmente semelhante à pele nativa foi obtido e usado para criar de forma eficiente um modelo 3D de queimadura de pele usando uma vara de aço inoxidável a 65 °C durante 120s. Especificamente, a abordagem experimental desenvolvida permitiu induzir uma queimadura caracterizada por morte celular localizada, ou seja, dentro da região da queimadura, sem afetar a viabilidade celular na região saudável circundante. De facto, o ensaio de Live/Dead sugere que a resposta celular na região da queimadura é dependente do tempo uma vez que células mortas foram detetadas apenas num período tardio após a lesão (7 dias), mas não ao dia 1 pós-lesão. Por último, uma estratégia de bioimpressão 3D foi implementada para criar um hidrogel que permita a perfusão diretamente num chip personalizado gerado por impressão 3D. Esta estratégia permitiu demonstrar a integração das abordagens experimentais desenvolvidas na dissertação com a finalidade de gerar modelos 3D vascularizados de queimaduras de pele. No geral, neste trabalho é reportado pela primeira vez o desenvolvimento de um modelo biomimético de pele in vitro recapitulando as principais características de queimaduras de pele com resultados promissores para aplicações de engenharia de tecidos, incluindo a reprodução de patologias de pele, o teste de fármacos e a cicatrização de feridas. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Skin burns are considered a major public health problem worldwide, being a leading cause of patient morbidity, pain, and, in some cases, disfigurement. Despite several therapies being commercially available, such as modern dressings and skin substitutes, there are still critical limitations regarding the development of more effective therapies that can diminish the occurrence of fibrosis and improve both aesthetic and functional outcomes. To do that, it is crucial to improve our understanding regarding the responses and mechanisms at cellular and extracellular matrix (ECM) level occurring upon injury. To address the mentioned limitations, herein a novel single-polymer bioink was developed to engineer pathophysiological relevant in vitro 3D models of skin burn wounds. First, a maleimide-functionalized pectin derivative (PectX-MAL) bioink was developed by using a dual-crosslinked strategy comprising ionic gelation and thiolMichael addition click chemistry. This strategy allowed not only to modulate the mechanical properties (2593.00 ± 261.50 to 5860.00 ± 386.10 Pa) of dual-crosslinked hydrogels in the range of native skin, but also to resemble other key biophysical and biochemical cues of skin ECM. A systematic study was carried out to evaluate the influence of degradable and non-degradable biscysteine crosslinkers on hydrogel properties and cellular response. Interestingly, all formulations allowed the spreading of dermal fibroblasts, though results suggest that degradable hydrogels further stimulate cell spreading. Furthermore, degradable hydrogels also increased the deposition of ECM components in comparison to the non-degradable hydrogels. In order to create an in vitro bilayer skin model, keratinocytes were seeded on top of a fibroblast-laden hydrogel and cultured for 28 days. After this time period, an in vitro skin model structurally similar to the native skin was obtained and used to efficiently create a 3D skin burn wound model by using a stainless-steel rod at 65 °C for 120s. Specifically, the developed experimental setup allowed to induce a burn wound characterized by site-specific cellular dead, i.e., within the burn area, while not affecting cellular viability in the surrounding unwounded region. Notably, Live/Dead assay suggests that cell response within the burn region is time-dependent as dead cells were only detected at a late time period after injury (7 days), but not at day 1 post-injury. Finally, a bioprinting strategy was implemented to engineer a perfusable hydrogel in a customized 3D printed chip as a proof-of concept demonstration towards the generation of vascularized 3D models of skin burns. Overall, in this work the development of an in vitro skin biomimetic model recapitulating key hallmarks of skin burn wounds is reported for the first time with promising outcomes for tissue engineering applications, including disease modelling, drug screening and wound healing. | pt_PT |
| dc.description.sponsorship | This work was carried out in the Biofabrication group at the Institute for Research and Innovation in Health Sciences (i3S) and was financed by European funds through European Regional Development Fund (ERDF), through COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Portugal 2020, and by Portuguese funds through "Fundação para a Ciência e a Tecnologia" (FCT)/"Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação" in the framework of Project "Institute for Research and Innovation in Health Sciences” (Ref. POCI-01-0145- FEDER-007274), PTDC/MEC-GIN/29232/2017 and Portugal-UK Bilateral Research Fund (PARSUK/FCT). | |
| dc.identifier.tid | 203113349 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.22/22173 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | pt_PT |
| dc.subject | Bioimpressão 3D | pt_PT |
| dc.subject | Click Chemistry | pt_PT |
| dc.subject | Hidrogel | pt_PT |
| dc.subject | Modelo de pele 3D | pt_PT |
| dc.subject | Pele | pt_PT |
| dc.subject | Queimadura de pele | pt_PT |
| dc.subject | 3D Bioprinting | pt_PT |
| dc.subject | 3D skin model | pt_PT |
| dc.subject | Burn wound | pt_PT |
| dc.subject | Hydrogels | pt_PT |
| dc.subject | Skin | pt_PT |
| dc.title | Bioprinting strategies to engineer biomimetic 3D models of skin burn wounds | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | embargoedAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| thesis.degree.name | Mestrado em Engenharia Biomédica | pt_PT |