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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Polyphenols are widspread in plant-based foodstufs contributing directly to their taste properties (astringency and bitter taste).Bitteness is perceived by avtivation of bitter aste receptors (TAS2Rs). Some polyphenols have been already identified as agonists for TAS2R5, TAS2R7 ND TAS2R39. The aim of this study was to express and isolate TAS2R5, TAS2R7 AN TAS2R39 on S. cerevisiae for further structure-activation studies. For this purpose, these TAS2Rs were expressed using a GFP-fusion yeast system. The transformants and the induction culture conditions (time, temperature, and addition of a chemical chaperone) were screened by whole-cell GFP fluorscence, immunoblotting and fluorscence microscopy. An increase of expression of TAS2Rs was observed whwn were induced with 2% of galactose at 20C (TARS2R5), 26C (TAS2R7), and with 2.5% of DMSO at 26C (TAS2R39) for 22 hours. Isolation of TAS2R has been proven difficult due to cell lysis inefficiency and protein degradation. This study allowed to get the insights on the best protein expression conditions for these TAS2Rs. The future work is focused on improving the isolation of these membrane proteins and finding alternative approaches. Ongoing work is developing two approaches based on a baculovirus expression ector system and on expression on an engineered GPCR-based signalling strain S. cerevisiae.
Os polifenóis existem em alimentos de origem vegetal, e contribuem diretamente para as propriedades organoléticas dos alimentos (adstringência ou sabor amargo). A perceção do gosto amargo ocorre pela ativação de recetores do sabor amargo (TAS2Rs). Alguns polifenóis já foram identificados como agonistas dos TAS2R5, TAS2R7 E TAS2R39. O objetivo deste dissertação foi expressar e isolar estes TAS2Rs para aprofundar a relação estrutura-atividade. Estes TAS2Rs foram expressos em S. cerevisiae através de um sistema de fusão com GFP. Os transformante e as condições de cultura de indução (tempo, temperatura e adição de chaperones químicas) ótimas foram estudadas através de "whole-cell fluorscence", "immunoblotting" e microscopia de fluorescência. Foi observado um aumento da expressão destes TAS2Rs estes foram induzidos com 2% galactose a 20c (TAS2R5), 26c (TAS2R7) e com 2.5% DMSO a 26c (TAS2R39) durante 22 horas. O isolamento dos TAS2Rs demonstrou-se difícil, devido à falta de eficiência da lise celular e da inibição proteica. Este estudo permitiu averiguar algumas condições de expressão dos três TAS2Rs. Este trabalho tem como perspetivas futuras melhorar a expressão e isolamento deste TAS2Rs e procurar abordagens alternativas. Estão em curso métodos alternativos baseados noutro sistema de expressão (em Baculovírus) e baseados na expressão numa estirpe S. cerevisiae geneticamente modificada com sistema de sinalização de GPCR.
Os polifenóis existem em alimentos de origem vegetal, e contribuem diretamente para as propriedades organoléticas dos alimentos (adstringência ou sabor amargo). A perceção do gosto amargo ocorre pela ativação de recetores do sabor amargo (TAS2Rs). Alguns polifenóis já foram identificados como agonistas dos TAS2R5, TAS2R7 E TAS2R39. O objetivo deste dissertação foi expressar e isolar estes TAS2Rs para aprofundar a relação estrutura-atividade. Estes TAS2Rs foram expressos em S. cerevisiae através de um sistema de fusão com GFP. Os transformante e as condições de cultura de indução (tempo, temperatura e adição de chaperones químicas) ótimas foram estudadas através de "whole-cell fluorscence", "immunoblotting" e microscopia de fluorescência. Foi observado um aumento da expressão destes TAS2Rs estes foram induzidos com 2% galactose a 20c (TAS2R5), 26c (TAS2R7) e com 2.5% DMSO a 26c (TAS2R39) durante 22 horas. O isolamento dos TAS2Rs demonstrou-se difícil, devido à falta de eficiência da lise celular e da inibição proteica. Este estudo permitiu averiguar algumas condições de expressão dos três TAS2Rs. Este trabalho tem como perspetivas futuras melhorar a expressão e isolamento deste TAS2Rs e procurar abordagens alternativas. Estão em curso métodos alternativos baseados noutro sistema de expressão (em Baculovírus) e baseados na expressão numa estirpe S. cerevisiae geneticamente modificada com sistema de sinalização de GPCR.
Description
Keywords
Polyphenols Bitterness Bitter taste receptors Protein expression Activation screening