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Publicação
Desenvolvimento de um teste rápido para detetar resistência antimicrobiana ambiental
| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 5.33 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Antimicrobial resistance (AMR) has become a global public health issue that threatens
the effective treatment of infectious diseases and is one of the major issues of our times.
Resistance genes can be acquired by bacteria, such as the qnr gene associated with quinolones
resistance. The acquired resistance mechanisms enable the transfer of the genetic material to
other non-resistant bacteria, both in the environment or hospital settings. The current methods
for AMR detection are the microbiology and molecular biology methods such as PCR
(Polymerase Chain Reaction), however, they are often labour-intensive, costly, and require
specialized, high-tech equipment and trained technicians. Thus, there is a need to respond to
the urgent demand for a rapid, cost-effective and accessible alternative for in-situ testing of
environmental monitoring.
This work, developed at LabRISE/ISEP (Porto Higher Institute of Engineering), aimed to
design and validate a colorimetric biosensor based on gold nanoparticles (AuNPs) for the
detection of qnr 3, a gene associated with quinolones in E. coli. The AuNPs were synthesized
using a modified Turkevich-Frens method. Functionalization with thiolated DNA sequences was
achieved using pH-assisted methods and incremental salt addition, the latter proving to be
more robust, allowing denser sequence coverage and greater tolerance to the increase of ionic
strength.
Hybridization tests indicated that the co-immobilization of spacer molecules, such as
mercaptohexanol (MCH), enhanced the biosensor’s sensitivity by achieving a 2-fold increase
compared to longer incubation times or absence of such modifiers. Optimization studies further
showed that the optimal MCH/DNA ratio was 3000:1. The effect of ionic strength on DNA-DNA
hybridization was also tested and analyzed using naked eye detection, while quantitative
analysis was performed with both spectral ratio and RGB-based approaches. The results
demonstrated that spectral ratio sensitivity increased 1.7-fold from the lowest ionic strength to
0.45 M NaCl, while the RGB-based sensitivity increased approximately 2-fold when comparing
the lowest ionic strength (0.25 M) with the optimal condition at 0.45 M NaCl, showing a similar
trend for both methods. The comparative analysis between these two methods confirms their
reliability to assess a colorimetric detection, showing the best sensing performance for the ionic
strength of 0.45 M.
The system was also evaluated using real environmental samples collected from the
Douro River. Under the optimized conditions, the spiked samples exhibited a 3.3-fold increase in sensitivity compared to measurements in buffer, while the linear range decreased from 0–80
nM to 0–40 nM, representing a 2-fold reduction in the upper limit of the linear range. The limit
of detection (LOD) was 25 nM in buffer and 17 nM in real samples.
In conclusion, the developed AuNP-based colorimetric biosensor demonstrated robust
analytical performance, with dual validation through spectral ratio and RGB-based analysis
enabling accurate quantitative assessment beyond naked eye detection. The developed
colorimetric biosensor was successfully applied to the detection of the target DNA in river
waters samples, confirming its reliability and applicability under real environmental conditions.
Overall, the biosensor proved to be an effective, portable, and a simple tool suitable for
in-situ environmental antimicrobial resistance monitoring.
A resistência antimicrobiana (RAM) é um problema de saúde pública com impacto a nível mundial, uma vez que ameaça o tratamento eficaz de doenças infeciosas, sendo um dos maiores desafios atuais. As bactérias têm a capacidade de adquirir genes de resistência, como é o caso do gene qnr associado à resistência às quinolonas. Os mecanismos de aquisição de resistência permitem a transferência de material genético para outras bactérias não resistentes, tanto no meio ambiente como em contexto clínico. Os métodos para a deteção da RAM tradicionalmente usados são a microbiologia e métodos de biologia molecular como o PCR; no entanto, são morosos, dispendiosos e há necessidade de laboratórios especializados, equipamento adequado e pessoal altamente treinado. Há, portanto, a necessidade urgente de desenvolver uma alternativa de diagnóstico mais rápida, económica e acessível para ser utilizada em análises in-situ para contexto de controlo ambiental. Este trabalho, desenvolvido no LabRISE/ISEP (Instituto Superior de Engenharia do Porto), teve como objetivo desenvolver e validar um biossensor colorimétrico baseado em nanopartículas de ouro (NPAus) para a deteção de qnr 3, um gene associado às quinolonas em E.coli. As NPAus foram sintetizadas através da adaptação do método de referência Turkevich- Frens. A funcionalização com sequências de ADN modificadas com tióis foi conseguida utilizando os métodos assistidos por pH e adição de sal, sendo que o último se revelou mais robusto, permitindo uma cobertura mais densa da sequência e maior tolerância ao aumento da força iónica. Os ensaios de hibridização revelaram que a co-imobilização de moléculas que funcionam como espaçadores, como é o caso do mercaptohexanol (MCH), aumentam a sensibilidade do biossensor, em cerca de duas vezes quando comparado com tempos de incubação mais longos ou até a ausência destas moléculas. Os estudos de otimização da hibridização de ADN-ADN demonstraram ainda que a razão ótima MCH/ADN foi de 3000:1. O efeito da força iónica na hibridização foi também testado e analisado por deteção visual, enquanto a análise quantitativa foi realizada através do rácio espectral e da abordagem baseada nas coordenadas de cor RGB. Os resultados demonstraram que a sensibilidade determinada pelo rácio espectral aumentou 1,7 vezes entre a força iónica mais baixa e 0,45 M de NaCl, enquanto a sensibilidade baseada em RGB aumentou aproximadamente 2 vezes comparando a menor força iónica (0,25 M) com a condição ideal a 0,45 M de NaCl, apresentando uma tendência semelhante em ambos os métodos. A análise comparativa entre as duas abordagens confirma a sua fiabilidade na avaliação da deteção colorimétrica, evidenciando o melhor desempenho para uma força iónica de 0,45 M. O sistema foi também avaliado com amostras ambientais reais recolhidas no Rio Douro. Em condições otimizadas, as amostras dopadas com ADN apresentaram um aumento de 3,3 vezes na sensibilidade em comparação com as medições em tampão, no entanto a gama linear diminuiu de 0–80 nM para 0–40 nM, correspondendo a uma redução de 2 vezes no limite superior da gama de linearidade. O limite de deteção (LOD, do inglês, Limit of Detection) foi de 25 nM em condições controladas (tampão) e 17 nM em amostras reais. Em conclusão, o biossensor colorimétrico com base em AuNPs desenvolvido demonstrou elevado desempenho analítico, com validação dupla através do rácio espectral e da análise baseada em RGB, permitindo uma avaliação quantitativa mais precisa do que a deteção visual. O biossensor desenvolvido permitiu a deteção do ADN alvo em amostras de águas fluviais, confirmando a sua fiabilidade e aplicabilidade em condições ambientais reais. Em suma, o sistema demonstrou ser uma ferramenta eficaz, portátil e simples, adequada para a monitorização in-situ da resistência antimicrobiana (RAM) em contextos ambientais.
A resistência antimicrobiana (RAM) é um problema de saúde pública com impacto a nível mundial, uma vez que ameaça o tratamento eficaz de doenças infeciosas, sendo um dos maiores desafios atuais. As bactérias têm a capacidade de adquirir genes de resistência, como é o caso do gene qnr associado à resistência às quinolonas. Os mecanismos de aquisição de resistência permitem a transferência de material genético para outras bactérias não resistentes, tanto no meio ambiente como em contexto clínico. Os métodos para a deteção da RAM tradicionalmente usados são a microbiologia e métodos de biologia molecular como o PCR; no entanto, são morosos, dispendiosos e há necessidade de laboratórios especializados, equipamento adequado e pessoal altamente treinado. Há, portanto, a necessidade urgente de desenvolver uma alternativa de diagnóstico mais rápida, económica e acessível para ser utilizada em análises in-situ para contexto de controlo ambiental. Este trabalho, desenvolvido no LabRISE/ISEP (Instituto Superior de Engenharia do Porto), teve como objetivo desenvolver e validar um biossensor colorimétrico baseado em nanopartículas de ouro (NPAus) para a deteção de qnr 3, um gene associado às quinolonas em E.coli. As NPAus foram sintetizadas através da adaptação do método de referência Turkevich- Frens. A funcionalização com sequências de ADN modificadas com tióis foi conseguida utilizando os métodos assistidos por pH e adição de sal, sendo que o último se revelou mais robusto, permitindo uma cobertura mais densa da sequência e maior tolerância ao aumento da força iónica. Os ensaios de hibridização revelaram que a co-imobilização de moléculas que funcionam como espaçadores, como é o caso do mercaptohexanol (MCH), aumentam a sensibilidade do biossensor, em cerca de duas vezes quando comparado com tempos de incubação mais longos ou até a ausência destas moléculas. Os estudos de otimização da hibridização de ADN-ADN demonstraram ainda que a razão ótima MCH/ADN foi de 3000:1. O efeito da força iónica na hibridização foi também testado e analisado por deteção visual, enquanto a análise quantitativa foi realizada através do rácio espectral e da abordagem baseada nas coordenadas de cor RGB. Os resultados demonstraram que a sensibilidade determinada pelo rácio espectral aumentou 1,7 vezes entre a força iónica mais baixa e 0,45 M de NaCl, enquanto a sensibilidade baseada em RGB aumentou aproximadamente 2 vezes comparando a menor força iónica (0,25 M) com a condição ideal a 0,45 M de NaCl, apresentando uma tendência semelhante em ambos os métodos. A análise comparativa entre as duas abordagens confirma a sua fiabilidade na avaliação da deteção colorimétrica, evidenciando o melhor desempenho para uma força iónica de 0,45 M. O sistema foi também avaliado com amostras ambientais reais recolhidas no Rio Douro. Em condições otimizadas, as amostras dopadas com ADN apresentaram um aumento de 3,3 vezes na sensibilidade em comparação com as medições em tampão, no entanto a gama linear diminuiu de 0–80 nM para 0–40 nM, correspondendo a uma redução de 2 vezes no limite superior da gama de linearidade. O limite de deteção (LOD, do inglês, Limit of Detection) foi de 25 nM em condições controladas (tampão) e 17 nM em amostras reais. Em conclusão, o biossensor colorimétrico com base em AuNPs desenvolvido demonstrou elevado desempenho analítico, com validação dupla através do rácio espectral e da análise baseada em RGB, permitindo uma avaliação quantitativa mais precisa do que a deteção visual. O biossensor desenvolvido permitiu a deteção do ADN alvo em amostras de águas fluviais, confirmando a sua fiabilidade e aplicabilidade em condições ambientais reais. Em suma, o sistema demonstrou ser uma ferramenta eficaz, portátil e simples, adequada para a monitorização in-situ da resistência antimicrobiana (RAM) em contextos ambientais.
Descrição
Palavras-chave
Antimicrobial Resistance Biosensor Gold Nanoparticles DNA probes Colorimetric detection