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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
The incidence of neurodegenerative disorders of the central nervous system (CNS) is increasing
worldwide, making them a leading cause of disability, particularly in aging populations. These
diseases involve a progressive decline in neuronal function, often accompanied by
neuroinflammation, that aims to protect and repair affected tissues but, when prolonged, can
lead to neurotoxicity and exacerbate disease progression. Microglia, the CNS’s immune cells,
are central to this process, releasing pro-inflammatory cytokines like TNF-a and IL-1β, which
recruit astrocytes and trigger extensive remodeling of the extracellular matrix (ECM), as well as
anti-inflammatory cytokines. Changes in ECM composition and mechanical properties that are
observed in pathological scenarios, such as alteration in stiffness, further influence cell behavior
and tissue homeostasis. Despite growing research, the interplay between microglia and ECM
mechanics in the context of neuroinflammation remains unclear, with no studies in the
literature using 3D in vitro models for exploring this topic.
Therefore, this study explored how ECM mechanical properties affect microglial behavior, in
the absence or presence of a neuroinflammatory stimulus, using a 3D tissue-engineered model
that replicates key features of the brain ECM.
Alginate hydrogels were prepared by mixing alginate solutions of varied oxidation status
modified with RGD and PVGLIG peptides. The modification of the alginate backbone with the
RGD peptide was chosen for its cell adhesion properties, while PVGLIG was used for its
sensitivity to matrix metalloproteinases. Primary microglia cultures were established from postnatal
day 1-2 Wistar Han rat pup cortices, and cells embedded within the hydrogels. The
mechanical properties of hydrogels with and without encapsulated microglia were analyzed
through rheology assays. Cell viability was studied using live-dead and resazurin assays, and cell
morphology and proliferation was assessed through immunocytochemistry for F-actin and Ki-
67, respectively. A pro-inflammatory stimulus of lipopolysaccharide (LPS) was added to the
culture and the resulting activation status was assessed by immunocytochemistry, quantitative
real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and measurement of nitrite production.
In order to replicate the alterations in the ECM environment during neuroinflammation, the
mechanical properties of the matrices were modified by adjusting the concentration of
alginate and the degree of oxidation, leading to the production of three distinct
formulations. Overall, we observed that the elastic modulus (G’) increased with higher alginate
concentration (weight/volume; w/v) and lower levels of alginate oxidation. On the other hand,
the viscous modulus (G’’) decreased when the alginate concentration (w/v) was doubled, and
the oxidation degree was maintained but didn’t change when the oxidation degree was halved
(while also doubling the alginate concentration). The complex modulus (G*) also increased with
higher alginate concentration (w/v) and lower oxidation, which was mainly attributed to the
significant increase in the elastic component. Rheological analysis of microglia-embedded hydrogels followed a similar pattern, yet showing
consistently lower values for all measured parameters, suggesting a substantial impact of cells
in the matrices’ mechanical properties. This impact is likely attributed not only to the
mechanical properties of the cells themselves, but also to their influence during the crosslinking
process. Live-dead assays confirmed over 60 % cell viability across all conditions.
Metabolic activity and nitrite production increased in all formulations following LPS stimulation,
with the softest condition showing the biggest increase. ICC assays revealed the difference in
the morphology of the cells, through F-actin, and an increase in Ki-67 expression, upon LPS
stimulation, with larger cell volumes observed in the formulations with a lower elastic modulus.
Sphericity was highest in the formulation with the highest elastic modulus. YAP1, responsible
for regulating cell growth, proliferation and apoptosis, showed an elevated expression and
subcellular localization in the nuclei in the softest condition with LPS. RT-qPCR analysis showed
increased expression of key inflammatory markers, including IL-6, NOS2, IL-10 and CD14, with
CD14 being the most upregulated gene, especially in the presence of LPS. TLR4, a pathway for
LPS to induce microglia activation, was downregulated in the matrices with higher alginate
concentration (w/v), thus higher elastic modulus. Therefore, the softest formulation showed
the highest gene expression response after LPS stimulation.
These findings suggest a likely interplay between ECM mechanical properties and microglial
function under LPS-induced activation, which aligns with the objectives of this project and the
preconceived expectations. This work will contribute to the discovery of new therapeutic
targets to tackle neuroinflammation and ultimately neurodegenerative diseases.
A incidência de doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (SNC) está a aumentar em todo o mundo, tornando-se uma das principais causas de incapacidade, particularmente nas populações mais idosas. Estas doenças envolvem um declínio progressivo da função neuronal, muitas vezes acompanhado de neuroinflamação, que visa proteger e reparar os tecidos afetados mas que, quando prolongada, pode levar à neurotoxicidade e exacerbar a progressão da doença. A microglia, conjunto de células imunitárias do SNC, é fundamental neste processo, libertando citocinas pró-inflamatórias como o TNF-a e a IL-1β, que recrutam astrócitos e desencadeiam uma extensa remodelação da matriz extracelular (MEC), bem como citocinas anti-inflamatórias. As alterações na composição da MEC e nas propriedades mecânicas observadas em cenários patológicos, como a alteração da rigidez, influenciam ainda mais o comportamento das células e a homeostase dos tecidos. Apesar do aumento progressivo na investigação, a interação da microglia e da mecânica da MEC na neuroinflamação permanece pouco claro, não existindo na literatura estudos que utilizem modelos 3D in vitro para explorar este tópico. Assim, este estudo explorou a forma como as propriedades mecânicas da MEC afetam o comportamento da microglia, na ausência ou presença de um estímulo neuroinflamatório, utilizando um modelo de engenharia de tecidos 3D que replica as principais caraterísticas da MEC do cérebro. Os hidrogéis de alginato foram preparados através da mistura de soluções de alginato com estado de oxidação variado modificadas com os péptidos RGD e PVGLIG. A modificação do suporte principal do alginato com o péptido RGD foi escolhida pelas suas propriedades de adesão celular, enquanto o PVGLIG foi utilizado pela sua sensibilidade às metaloproteinases da matriz. As culturas primárias de microglia foram estabelecidas a partir de córtices de “pups” de ratos Wistar Han, no dia 1-2 pós-natal, e as células foram incorporadas nos hidrogéis. As propriedades mecânicas dos hidrogéis com e sem microglia foram analisadas através de ensaios reológicos. A viabilidade celular foi estudada através de ensaios de “live-dead” e resazurina, e a morfologia e proliferação celular foram avaliadas através de imunocitoquímica para F-actina e Ki-67, respetivamente. Foi adicionado à cultura um estímulo pró-inflamatório de lipopolissacárido (LPS) e o estado de ativação resultante foi avaliado por imunocitoquímica, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e medição da produção de nitritos. Para reproduzir as alterações no ambiente da MEC durante a neuroinflamação, as propriedades mecânicas das matrizes foram modificadas através do ajuste da concentração de alginato e do grau de oxidação, levando à produção de três formulações distintas. Em geral, observámos que o módulo de elasticidade (G') aumentou com uma maior concentração de alginato (peso/volume; p/v) e menores níveis de oxidação do alginato. Por outro lado, o módulo de viscosidade (G'') diminuiu quando a concentração de alginato (p/v) foi duplicada e o grau de oxidação foi mantido, mas não se alterou quando o grau de oxidação foi reduzido para metade (duplicando também a concentração de alginato). O módulo complexo (G*) também aumentou com uma maior concentração de alginato (p/v) e menor oxidação, o que foi atribuído principalmente ao aumento significativo da componente elástica. A análise reológica dos hidrogéis incorporados com microglia seguiu um padrão semelhante, mas apresentou valores consistentemente mais baixos para todos os parâmetros medidos, sugerindo um impacto substancial das células nas propriedades mecânicas das matrizes. Este impacto é provavelmente atribuído não só às propriedades mecânicas das próprias células, mas também à sua influência durante o processo de reticulação. Os ensaios de “live-dead” confirmaram uma viabilidade celular superior a 60 % em todas as condições. A atividade metabólica e a produção de nitritos aumentaram em todas as formulações após a estimulação com LPS, tendo a condição mais mole apresentado o maior aumento. Os ensaios ICC revelaram a diferença na morfologia das células, através da F-actina, e um aumento na expressão de Ki-67, após a estimulação com LPS, com maiores volumes de células observados nas formulações com um módulo de elasticidade mais baixo. A esfericidade foi mais elevada na formulação com o módulo de elasticidade mais elevado. YAP1, responsável pela regulação do crescimento celular, proliferação e apoptose, mostrou uma expressão elevada e localização subcelular nos núcleos na condição mais mole com LPS. A análise de RT-qPCR mostrou um aumento da expressão de marcadores inflamatórios, incluindo IL-6, NOS2, IL-10 e CD14, sendo o CD14 o gene mais regulado, especialmente na presença de LPS. O TLR4, uma via para o LPS induzir a ativação da microglia, foi desregulado nas matrizes com maior concentração de alginato (p/v), o que resultou num módulo de elasticidade mais elevado. Por conseguinte, a formulação mais mole apresentou a resposta de expressão genética mais elevada após a estimulação com LPS. Estes resultados sugerem uma provável interação entre as propriedades mecânicas da ECM e a função microglial sob ativação induzida por LPS, o que se alinha com os objetivos deste projeto e com as expectativas preconcebidas. Este trabalho contribuirá para a descoberta de novos alvos terapêuticos para combater a neuroinflamação e, em última análise, as doenças neurodegenerativas.
A incidência de doenças neurodegenerativas do sistema nervoso central (SNC) está a aumentar em todo o mundo, tornando-se uma das principais causas de incapacidade, particularmente nas populações mais idosas. Estas doenças envolvem um declínio progressivo da função neuronal, muitas vezes acompanhado de neuroinflamação, que visa proteger e reparar os tecidos afetados mas que, quando prolongada, pode levar à neurotoxicidade e exacerbar a progressão da doença. A microglia, conjunto de células imunitárias do SNC, é fundamental neste processo, libertando citocinas pró-inflamatórias como o TNF-a e a IL-1β, que recrutam astrócitos e desencadeiam uma extensa remodelação da matriz extracelular (MEC), bem como citocinas anti-inflamatórias. As alterações na composição da MEC e nas propriedades mecânicas observadas em cenários patológicos, como a alteração da rigidez, influenciam ainda mais o comportamento das células e a homeostase dos tecidos. Apesar do aumento progressivo na investigação, a interação da microglia e da mecânica da MEC na neuroinflamação permanece pouco claro, não existindo na literatura estudos que utilizem modelos 3D in vitro para explorar este tópico. Assim, este estudo explorou a forma como as propriedades mecânicas da MEC afetam o comportamento da microglia, na ausência ou presença de um estímulo neuroinflamatório, utilizando um modelo de engenharia de tecidos 3D que replica as principais caraterísticas da MEC do cérebro. Os hidrogéis de alginato foram preparados através da mistura de soluções de alginato com estado de oxidação variado modificadas com os péptidos RGD e PVGLIG. A modificação do suporte principal do alginato com o péptido RGD foi escolhida pelas suas propriedades de adesão celular, enquanto o PVGLIG foi utilizado pela sua sensibilidade às metaloproteinases da matriz. As culturas primárias de microglia foram estabelecidas a partir de córtices de “pups” de ratos Wistar Han, no dia 1-2 pós-natal, e as células foram incorporadas nos hidrogéis. As propriedades mecânicas dos hidrogéis com e sem microglia foram analisadas através de ensaios reológicos. A viabilidade celular foi estudada através de ensaios de “live-dead” e resazurina, e a morfologia e proliferação celular foram avaliadas através de imunocitoquímica para F-actina e Ki-67, respetivamente. Foi adicionado à cultura um estímulo pró-inflamatório de lipopolissacárido (LPS) e o estado de ativação resultante foi avaliado por imunocitoquímica, reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR) e medição da produção de nitritos. Para reproduzir as alterações no ambiente da MEC durante a neuroinflamação, as propriedades mecânicas das matrizes foram modificadas através do ajuste da concentração de alginato e do grau de oxidação, levando à produção de três formulações distintas. Em geral, observámos que o módulo de elasticidade (G') aumentou com uma maior concentração de alginato (peso/volume; p/v) e menores níveis de oxidação do alginato. Por outro lado, o módulo de viscosidade (G'') diminuiu quando a concentração de alginato (p/v) foi duplicada e o grau de oxidação foi mantido, mas não se alterou quando o grau de oxidação foi reduzido para metade (duplicando também a concentração de alginato). O módulo complexo (G*) também aumentou com uma maior concentração de alginato (p/v) e menor oxidação, o que foi atribuído principalmente ao aumento significativo da componente elástica. A análise reológica dos hidrogéis incorporados com microglia seguiu um padrão semelhante, mas apresentou valores consistentemente mais baixos para todos os parâmetros medidos, sugerindo um impacto substancial das células nas propriedades mecânicas das matrizes. Este impacto é provavelmente atribuído não só às propriedades mecânicas das próprias células, mas também à sua influência durante o processo de reticulação. Os ensaios de “live-dead” confirmaram uma viabilidade celular superior a 60 % em todas as condições. A atividade metabólica e a produção de nitritos aumentaram em todas as formulações após a estimulação com LPS, tendo a condição mais mole apresentado o maior aumento. Os ensaios ICC revelaram a diferença na morfologia das células, através da F-actina, e um aumento na expressão de Ki-67, após a estimulação com LPS, com maiores volumes de células observados nas formulações com um módulo de elasticidade mais baixo. A esfericidade foi mais elevada na formulação com o módulo de elasticidade mais elevado. YAP1, responsável pela regulação do crescimento celular, proliferação e apoptose, mostrou uma expressão elevada e localização subcelular nos núcleos na condição mais mole com LPS. A análise de RT-qPCR mostrou um aumento da expressão de marcadores inflamatórios, incluindo IL-6, NOS2, IL-10 e CD14, sendo o CD14 o gene mais regulado, especialmente na presença de LPS. O TLR4, uma via para o LPS induzir a ativação da microglia, foi desregulado nas matrizes com maior concentração de alginato (p/v), o que resultou num módulo de elasticidade mais elevado. Por conseguinte, a formulação mais mole apresentou a resposta de expressão genética mais elevada após a estimulação com LPS. Estes resultados sugerem uma provável interação entre as propriedades mecânicas da ECM e a função microglial sob ativação induzida por LPS, o que se alinha com os objetivos deste projeto e com as expectativas preconcebidas. Este trabalho contribuirá para a descoberta de novos alvos terapêuticos para combater a neuroinflamação e, em última análise, as doenças neurodegenerativas.
Description
The research described in this thesis was financially supported by: Air Force Office of Scientific Research (USA) under the Award number FA9550-23-1-0599.
Keywords
Microglia Extracellular matrix Alginate Hydrogels Neuroinflammation Microglia Matriz extracelular Alginato Hidrogéis Neuroinflamação