Percorrer por autor "Rodrigues, Fernando"
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- Contributos da citologia analítica para estudos de biologia de levedurasPublication . Côrte-Real, Manuela; Sansonetty, Filipe; Ludovico, Paula; Fortuna, Margarida; Sousa, Maria João; Silva, Manuel Teixeira da; Leão, Cecília; Prudêncio, Cristina; Rodrigues, FernandoNeste artigo começamos por apresentar uma breve introdução à citologia analítica descrevendo alguns conceitos importantes desta disciplina bem como um dos instrumentos que a torna possível - o citómetro de fluxo. Referimos alguns dos aspectos relevantes desta instrumentação, em particular a possibilidade de medir a estrutura e o funcionamento de células vivas e de separar sub-populações celulares para posterior obtenção de culturas puras. Discutimos ainda os fundamentos de algumas aplicações e apresentamos os resultados obtidos nos nossos laboratórios com os seguintes estudos: i) efeitos de fungicidas no ciclo celular de leveduras; ii) relação entre a presença de proteínas de efluxo activas e a menor susceptibilidade de leveduras a antifúngicos; iii) avaliação de alterações estruturais e funcionais induzidas pelo ácido acético e sua relação com perda de viabilidade celular em populações de Saccharomyces cerevisiae e Zygosaccharomyces bailii; iv) determinação do potencial de membrana mitocondrial e avaliação da função mitocondrial de leveduras; v) determinação da ploidia de DNA em leveduras; vi) monitorização in vivo de processos celulares em S. cerevisiae e vii) morte celular programada induzida pelo ácido acético em S. cerevisiae. No decurso destes trabalhos, optimizámos diferentes protocolos de marcação celular recorrendo aos seguintes fl uorocromos: SYBR® Green I para a marcação de DNA; calceína-M, BCECF-AM, Rh123 e DiOC5 para a detecção de proteínas de efl uxo activo; DAF, FUN-1®, IP e Rh123 para a avaliação da integridade estrutural e funcional da célula; Rh123 para a avaliação de potencial de membrana mitocondrial, anexina V-FITC para a detecção de fosfatidilserina no folheto externo da membrana citoplasmática e FITC conjugado com dUTP (reacção de TUNEL) para a detecção de fragmentação internucleosomal de DNA.
- Exploring the genetic links between voltage-gated potassium channels and familial non-medullary thyroid carcinoma: a family studyPublication . Teixeira, Elisabete; Rodrigues, Lia; Cardoso, Marta; Fernandes, Cláudia; Paula, Arnaud da Cruz; Lima, Raquel; Ferreira, Marta; Martins, Teresa; Fernandes, Andreia; Rodrigues, Fernando; Prazeres, Hugo; Soares, Paula; Rodrigues, LiaOur team identified a family where 5 elements developed thyroid cancer between the ages of 26 and 38. Since no syndromic form of the disease was found, the diagnosis was of familial non-medullary thyroid carcinoma (FNMTC). Our team employed Whole-Exome Sequencing (WES) and identified a new potentially pathogenic germline mutation in the KCNB2 gene [ p.(Gly106Arg)]. KCNB2 encodes a voltage-gated potassium channel (vgKCN), and the detected missense mutation is localized in the tetramerization domain of the protein, possibly affecting its assembly and KC efflux. Since KC efflux by the cell is a necessary condition for cellular homeostasis, channel disruption can impact the function of other ion channels nearby. Mice studies showed that KCNE2 disruption indirectly impairs sodium-iodide symporter (NIS) function, and therefore iodide uptake by the cell, resulting in hypothyroidism or follicular nodular disease. Hypothesis By indirect effect on NIS function vgKCN mutations may increase predisposition to thyroid cancer and interfere with radioiodine (RAI) therapy response. We conducted in silico studies using two different NGS databases, TCGA and one in-house oncocytic tumors database (513 and 18 patients, respectively). Alterations in 59 genes were searched for copy-number variation, point mutations and other genetic alterations. in vitro assays using the FRTL-5 cell line are being performed. FRTL-5 cells were transfected with overexpression vectors containing either KCNB2 wild-type or KCNB2 mutated sequences, and the empty vector (EV) as a negative control. Expression of thyroid markers (e.g. NIS, TSH receptor, Thyroglobulin and TPO) was evaluated by qPCR and cell viability by PrestoBlue assay. Protein expression of thyroid markers will be assessed by Western blot. Cell cycle and apoptosis through flow cytometry, cell morphology by phalloidin assay, and cell colony formation by crystal violet. Transformed cells will further be treated with Guangxitoxin-1E, a potent KCNB1 / KCNB2 inhibitor. Our in silico results show that vgKCN mutations are rare events in thyroid cancer [19/488 (4%) in TCGA; 3/18 (17%) in our in-house database]. BRAF and NRAS alterations are frequent events in vgKCN altered tumors (58% and 16%, respectively). No KCNB2 pathogenic mutations were observed. vgKCN mutations were not correlated with patient prognosis. Our in vitro preliminary results show that KCNB2 mutated cells present higher expression of the channel than KCNB2 wild-type cells. No differences in cell viability were found between KCNB2 wild-type and mutated cells. If confirmed, vgKCN mutations may identify patients with altered RAI response, serving as thyroid cancer markers and potential pharmacological targets.