Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.22/2369
Título: Identification of neuronal alterations induced by Shank3 mutations using iPS cells from Phelan-McDermid Patients' Fibroblasts
Autor: Martins, Manuella
Orientador: Sala, Carlo
Palavras-chave: Shank3
Células estaminais pluripotente induzidas (iPS)
Autism Spectrum Disorder (ASD)
Phelan-McDermid Sindrome (PMS)
mGluR5
Induced-pluripotent stem (iPS) cells
Cellule staminali pluripotente indotte (iPS)
Data de Defesa: 2013
Editora: Instituto Politécnico do Porto. Escola Superior de Tecnologia da Saúde do Porto
Resumo: A família de proteínas Shank é o principal conjunto de proteinas de suporte e está localizada na densidade pós-sináptica das sinapses excitatórias. Existem 3 genes na família Shank, Shank1, Shank2 e Shank3 e são caracterizados por múltiplos domínios repetidos de anquirina próximo ao N-terminal seguido pelos domínios Src homologo 3 e PDZ, uma região longa rica em prolina e um domínio de motivo α estéril próximo ao C-terminal. Shank proteínas conectam duas subunidades de receptors glutamatérgicos, recetores NMDA e recetores metabotrópicos de glutamato do tipo-I (mGluRs). O domínio PDZ da Shank conecta-se ao C-terminal do GKAP e este, liga-se, ao complexo recetor PSD-95-NMDA. Por outro lado, a proteína Homer interage com o domínio rico em prolina para confirmar a associação entre a proteína Shank com o mGluR tipo-I. A proteína específica em estudo, Shank3, é haploinsuficiente em pacientes com sindrome Phelan-McDermid devido à deleções no braço comprido do cromossoma 22 levando à danos intelectuais, ausência ou atraso no discurso, comportamentos semelhantes ao autismo, hipotonia e características dismórficas. Neste trabalho, investigamos o papel da Shank3 na função sináptica para compreender a relação entre alterações nesta proteína e as características neurológicas presente em Pacientes com síndrome Phelan-McDermid. Foram utilizados dois modelos diferentes, ratinhos knockout Shank3 e hiPSC de pacientes com PMS. Ratinhos geneticamente modificados são ferramentas uteis no estudo de genes e na compreensão dos mecanismos que experiências in vitro não são capazes de reproduzir, mas de maneira a compreender melhor as patologias humanas, decidimos trabalhar também com células humanas. Os fibroblastos dos pacientes com síndrome Phelan-McDermid fora reprogramados em hiPS cells, diferenciados em neurónios e comparados com os neurónios obtidos a partir de doadores saudavéis e da mesma idade. A reprogramação em iPSC foi realizada por infecção de lentivirus com quatro genes de reprogramação OCT4, c-MYC, SOX2 e KFL4 para posteriormente serem diferenciados em neurónios, com cada passo sendo positivamente confirmado através de marcadores neuronais. Através dos neurónios diferenciados, analisamos a expressão de proteínas sinápticas. Pacientes com haploinsuficiencia na proteína Shank3 apresentam níveis elevados de proteína mGluR5 e decrescidos de proteína Homer sugerindo que a haploinsuficiencia leva a desregulação do complexo mGluR5-Homer-Shank3 conduzindo também, a defeitos na maturação sináptica. Assim, a expressão da proteína mGluR5 está alterada nos pacientes com PMS podendo estar relacionada com defeitos encontrados na diferenciação neuronal e maturação sináptica observados nos neurónios de pacientes. Conclusivamente, iPS cells representam um modelo fundamental no estudo da proteína Shank3 e a sua influência no sindrome de Phelan-McDermid.
Shank proteins family are the major scaffold proteins that organize postsynaptic density (PSD) at excitatory synapses. The three genes, SHANK1, SHANK2, SHANK3 encode large scaffold proteins containing an ankyrin repeat near the N terminus followed by Src homology 3 and PDZ domains, a long proline-rich region and a sterile α motif domain at the C terminus. These proteins molecularly link two glutamate receptors subtypes, NMDA receptors and type-I metabotropic GluR (mGluRs). The Shank PDZ domain binds to C terminus of GKAP, which binds to PSD-95-NMDA receptor complex. Homer interaction with proline-rich domain ensures the association of Shank with type I mGluRs. SHANK3 gene haploinsufficiency is likely to cause the majority neurological features associated with 22q13 deletion/Phelan-McDermid syndrome such as, intellectual impairment, absent or delayed speech and autistic-like behaviour. In this study, we investigated Shank3 role in synaptic function to understand why alterations in this protein can cause the neurological features presented by Phelan-McDermid Syndrome patients. We used two different models, shank3 KO mice and hiPS cells derived from Phelan-McDermid patients. Genetically modified mice are useful tools for investigating gene function and comprehending better mechanisms that in vitro experiments cannot reproduce, but to understand better human pathologies, we work also with human cells. We reprogrammed Phelan-McDermid Patients’ fibroblasts into hiPS cells, differentiated them into neurons and compare with neurons obtained from healthy age-matched donors. The patients’ fibroblasts were reprogrammed into iPS cells, by lentivirus infection with four reprogramming genes OCT4, c-MYC, SOX2 and KFL4, to posteriorly be differentiated into neuron with every step successfully confirmed by precise neuronal markers. Through differentiated neurons characterization we analysed Shank3 protein expression as well as other synaptic proteins. Patients’ neurons with Shank3 haploinsufficiency showed increased mGluR5 protein levels and decreased Homer protein levels suggesting that haploinsufficiency lead to deregulation of the mGlur5-Homer-Shank3 complex and reduced levels of Shank3 protein cause defects in synapses maturation. Therefore, mGluR5 expression is altered in PMS patients and this should be correlated with defects that we found in neuronal differentiation and synapses maturation observed in neurons derived from PMS patients. Concluding iPS cells represent a useful model to study the role of Shank3 in the pathogenesis of PMS.
La famiglia di proteine Shank sono proteine scaffold codificate da tre geni shank1, shank2 e shank3. Queste proteine hanno un peso molecolare maggiore di 200 kDa e la loro struttura comprende un dominio ankyrin repeats vicino dall’estremità N-terminale, un dominio SH3, un dominio PDZ, una lunga regione ricca di proline e un dominio SAM all’estremità C-terminale. Le proteine Shank sono in grado di legare due tipi di recettori glutamatergici, i recettori NMDA e i recettori metabotropi per il glutammato di tipo I (mGluR1, mGluR5).L’interazione tra Shank e i recettori mGluR avviene attraverso il legame di Homer alla regione ricca in proline di Shank. Mentre l’interazione tra Shank e i recettori NMDA avviene grazie al legame tra il dominio PDZ di Shank e la sequenza C-terminale della proteina GKAP. L’aploinsufficienza del gene shank3 è la causa “strutturale” del quadro clinico neurologico associato alla sindrome da delezione 22q13o sindrome di Phelan-McDermid. Gli individui affetti presentano ipotonia neonatale, ritardo globale dello sviluppo, assenza o ritardo di linguaggio e lievi segni dismorfici. In questo lavoro è stato studiato il ruolo della proteina shank3 nella sinapsi per capire come le alterazioni di questa proteina causino alterazioni neurologiche associate alla sindrome di Phelan McDermid. Per questo studio sono stati utilizzati due modelli di patologia, topi trangenisci KO per il gene shank3 e cellule ottenute da pazienti affetti dalla sindrome di Phelan McDermid. Gli animali transgenici rappresentano sicuramente un buon modello per studiare i difetti genetici, ma per capire meglio le alterazioni presenti nei pazienti abbiamo deciso di utilizzare anche cellule umane ottenute direttamenti da pazienti affetti da questa sindrome. In particolare abbiamo utilizzato fibroblasti che sono stati riprogrammati in cellule iPS, ossia cellule staminali pluripotenti indotte, attraverso l’uso di un vettore lentivirale esprimente 4 geni di riprogrammazione OCT4, c-MYC, SOX2 and KFL4. Queste cellule sono state differenziate in neuroni, che sono stati studiati per trovare eventuali alterazioni nella composizione e nella maturazione sinaptica. I dati ottenuti mostrano un aumento dei livelli di espressione del recettore metabotropico per il glutammato mGluR5 e una diminuzione dell’espressione della proteina Homer nei pazienti affetti da aploinsufficienza per il gene shank3, suggerendo che l’assenza di shank3 può causare una disregolzione del compleso proteico formato da mGluR5-Homer-Shank3. L’alterzione dell’espressione proteica del mGluR5, potrebbe essere correlato ai difetti nella maturazione sinaptica e nel differenziamento neuronale che sono stati riscontrati nei neuroni ottenuti da questi pazienti. In conclusione dunque le cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPs) rappresentano un buon modello per lo studio del ruolo di shank3 nella patogenesi della sindrome di Phelan McDermid.
Peer review: yes
URI: http://hdl.handle.net/10400.22/2369
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